優化培養基配方減少無機硒對粗毛纖孔菌的抑制作用，同時提高富硒菌絲的產量（一）
粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)屬于銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)纖孔菌屬(Inonotus),又名粗毛黃褐孔,是一種珍惜的藥用真菌。該菌以寄生為主,主要分布于新疆、寧夏、內蒙古、黑龍江、吉林等北溫帶地區。該菌在民間作為“桑黃”采集入藥,常用于糖尿病、痛風、關節炎等疾病。經國內專家學者對該菌進行考證,發現該菌即為古代中藥“桑黃”。此外,大量研究表明該菌具有多種生物活性,如抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、活血化瘀、保肝及提高免疫力等作用。目前對該菌的研究主要集中在鑒定、菌種篩選、栽培以及多糖、酚類化合物、三萜等生物活性代謝物及小分子化合物的提取及研究方面。
已有研究表明,食藥用菌如平菇、雙孢菇、雨傘菇、草菇、榆黃菇、牛肝菌、靈芝等具有轉化無機硒并積累有機硒元素的有效機制。理論上野生食藥用菌中硒含量應具較高水平,但實際上大多數野生食藥用物種都處于硒缺乏狀態,每克子實體干重含硒濃度小于1μg。研究表明,食藥用菌積累微量營養素的能力受土壤基質、真菌種類和元素類型的影響,且生長基質中硒的濃度也會阻礙食藥用菌菌絲的生長和子實體的形成。因此,了解食藥用菌對無機硒的耐受度及合理的富硒培養基成分是生產富硒功能性食藥用菌的前提條件。現如今,關于粗毛纖孔菌對無機硒的耐受度及富硒培養基成分還鮮有報道。本研究通過響應面法對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長培養基成分進行優化,旨在減少無機硒對粗毛纖孔菌的抑制作用,最大程度保證該菌菌絲能夠在富硒的同時,正常甚至更好地生長,提高富硒菌絲的產量。
1材料與方法
1.1材料與儀器
粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)福建農林大學國家菌草工程技術研究中心提供;亞硒酸鈉西亞試劑公司;葡萄糖西隴科學股份有限公司;硫酸鎂阿拉丁工業有限公司;磷酸二氫鉀西隴科學股份有限公司;VB1山東西亞化學工業有限公司;濃硝酸南京化學試劑股份有限公司;母種培養基為改良PDA培養基:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖30 g/L、硫酸鎂0.75 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、維生素B1(VB1)1 mg/L、瓊脂15 g/L。
LDZX-50FBS高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠;SW-CJ-2A超凈工作臺蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;HPX-9272MBE電熱恒溫培養箱上海博迅實業有限公司;X-seriesⅡ電感耦合等離子體質譜儀Thermo股份有限公司。
1.2實驗方法
1.2.1母種活化及接種取粗毛纖孔菌斜面母種約0.25 cm2接種于改良PDA平板中,倒置于恒溫培養箱30℃暗光培養。待菌絲生長覆蓋至平板2/3左右,于菌落邊緣取直徑為0.6 cm活化菌塊作為后續實驗母種。
1.2.2單因素實驗
1.2.2.1硒濃度對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響以改良PDA培養基為基礎,向其中添加1 mg/mL亞硒酸鈉溶液,通過梯度稀釋法配制硒濃度分別為2.33、4.66、9.31、18.63、37.25、74.5、149、298和596 mg/L的供試培養基,以無硒添加的改良PDA培養基為對照(CK)。將供試培養基注入滅菌(121℃、20 min)后的培養皿,每皿約25 mL,冷卻凝固后接入直徑為0.6 cm的活化菌塊,每個濃度5個重復。30℃暗光倒置培養8 d后,觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,使用游標卡尺利用十字交叉法精確測量菌落生長直徑,記錄數據。
1.2.2.2常規培養料對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響以改良PDA培養基為基礎,分別配制麩皮、玉米粉、大米、豆粉培養基,用以篩選粗毛纖孔菌菌絲最適生長培養料。其中:
麩皮培養基:麩皮50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。
玉米粉培養基:玉米粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。
大米培養基:大米50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。
豆粉培養基:豆粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。
每種培養基5個重復,30℃暗光倒置培養8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數據。
1.2.2.3補充碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響以改良PDA培養基為基礎,將培養基中的葡萄糖(30 g/L)調整為等量蔗糖、乳糖、果糖或海藻糖,每種培養基5個重復,30℃暗光倒置培養8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數據。
1.2.2.4培養基pH對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響多數食藥用菌適宜在微酸和中性pH條件下生長,因此,以改良PDA培養基為基礎,將培養基pH分別調整為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,每種培養基5個重復,30℃暗光倒置培養8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數據。
1.2.3 Box-Behnken design優化粗毛纖孔菌菌絲富硒培養基配方為考察培養基各成分與外源硒對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響及其之間的交互效應,以單因素實驗結果為依據,以粗毛纖孔菌菌絲生長速度為指標(Y),在最適pH條件下,采用Box-Behnken模型設計三因素、三水平組合實驗(表1),對結果進行響應面分析,得到最優響應Y值,從而得到最佳富硒粗毛纖孔菌菌絲培養基配方。
表1 BBD實驗因素水平表
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