巨大芽孢桿菌BM24生長(zhǎng)曲線、耐藥性、益生潛力評(píng)估及藥敏試驗(yàn)（一）
摘要
本試驗(yàn)旨在評(píng)估一株從健康細(xì)毛羊糞便中分離得到的巨大芽孢桿菌BM24的體外益生潛力及體內(nèi)安全性。采集飼養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有添加抗生素的健康新疆細(xì)毛羊的新鮮糞便，先通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、生化鑒定、16S rRNA測(cè)序，初步獲得羊源芽孢桿菌菌株，后續(xù)通過(guò)對(duì)酸和高濃度膽鹽環(huán)境的耐受性，以及菌株的體外抗菌能力、耐藥性、溶血活性和生長(zhǎng)曲線等方面的檢測(cè)，初步判斷分離出的芽孢桿菌菌株的體外安全性，最后進(jìn)行小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，評(píng)估其安全性。結(jié)果表明:1)初步分離得到1株羊源芽孢桿菌，結(jié)合生化鑒定和測(cè)序結(jié)果確定為巨大芽孢桿菌，將其命名為巨大芽孢桿菌BM24;2)該菌株可在pH=1.0條件下存活，0.3%膽鹽培養(yǎng)4 h后存活率為49%，在15種常見(jiàn)抗生素中對(duì)12種抗生素高度敏感，對(duì)常見(jiàn)腹瀉致病菌沙門氏菌和大腸桿菌抑制效果較好，無(wú)溶血活性;3)該菌株在37℃培養(yǎng)2 h后進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，6 h后進(jìn)入生長(zhǎng)平穩(wěn)期;4)灌胃該菌株后小鼠無(wú)死亡、體重變化正常，剖檢體腔臟器無(wú)眼觀病理現(xiàn)象，對(duì)肝臟、腎臟、脾臟指數(shù)及血細(xì)胞指標(biāo)均無(wú)顯著影響(P>0.05);腹腔注射該菌株，小鼠體征正常、無(wú)死亡現(xiàn)象，體腔臟器無(wú)眼觀病理變化。綜上可知，本試驗(yàn)分離得到的羊源巨大芽孢桿菌BM24具有良好的體外益生潛力，且無(wú)急性毒性作用，可作為羊源益生菌的候選菌株。
近年來(lái)，由于養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的過(guò)度使用，導(dǎo)致耐藥菌株增多、藥物殘留、污染環(huán)境、甚至危害人體健康等問(wèn)題頻發(fā)，2020年7月，我國(guó)開(kāi)始全面禁止使用促進(jìn)生長(zhǎng)的抗生素作為飼料添加劑，因此開(kāi)發(fā)綠色健康的飼料添加劑是大勢(shì)所趨，已有研究證明益生菌可作為常規(guī)抗生素飼料添加劑的替代品，發(fā)揮調(diào)節(jié)動(dòng)物的腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能、促進(jìn)消化與吸收、提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能等有益作用。
芽孢桿菌是一類能夠在逆境下形成內(nèi)生孢子以抵制不良環(huán)境的飼用益生菌，正是因?yàn)檠挎邨U菌能夠產(chǎn)生內(nèi)生孢子的這一特性，使得其相較于其余幾種常用益生菌更具優(yōu)勢(shì)，目前畜禽業(yè)飼料添加劑中廣泛應(yīng)用的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等。巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)作為芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，常見(jiàn)于土壤、植物表面和水底沉淀物中，具有解磷固氮、消除異味、凈化水體、改善養(yǎng)殖環(huán)境、提高機(jī)體免疫力、改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能等作用。Yao等研究發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌可改善哺乳犢牛的生長(zhǎng)性能，提高免疫功能及腸道氧化狀態(tài);貢笑笑等研究發(fā)現(xiàn)，土壤來(lái)源的巨大芽孢桿菌1259制劑能夠促進(jìn)山羊瘤胃細(xì)菌豐度以及腸道中有益微生物的增殖，提高荷斯坦奶牛標(biāo)準(zhǔn)乳產(chǎn)量;飼料中添加60 mg/kg巨大芽孢桿菌1259可顯著增加56日齡揚(yáng)州鵝體重，縮短出欄時(shí)間，提高經(jīng)濟(jì)效益。
研究顯示，微生物的益生特性與宿主種屬特異性有關(guān)，同一宿主來(lái)源的微生物更易于在該宿主腸道定植并表達(dá)其生物活性，并可改善宿主的生長(zhǎng)性能與腸道健康。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)羊源益生性巨大芽孢桿菌的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬從成年健康新疆細(xì)毛羊糞便分離出具有拮抗病原菌、對(duì)抗生素敏感的潛在益生性芽孢桿菌，并評(píng)估其耐受性、溶血活性、體內(nèi)安全性，目的是為羊源益生性芽孢桿菌的開(kāi)發(fā)提供參考，也為羊用微生態(tài)制劑在新疆養(yǎng)羊業(yè)中的應(yīng)用提供理論支持。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1糞便樣品和試驗(yàn)動(dòng)物
糞便樣品來(lái)源于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院試驗(yàn)基地飼養(yǎng)的成年雄性新疆細(xì)毛羊，飼糧為精飼料和苜蓿，自由飲水，并經(jīng)獸醫(yī)健康認(rèn)定無(wú)抗生素使用史。無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性昆明小鼠，共20只，體重(26±2)g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由采食和飲水。
1.1.2主要試劑及供試菌株
LB肉湯及瓊脂培養(yǎng)基、HBI芽孢桿菌生化鑒定條購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;脫纖維綿羊血、牛膽鹽購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;細(xì)菌藥敏紙片(批號(hào):20172400206)為杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品;牛源大腸桿菌K99、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌菌株為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室保存菌株。
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