微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)儀測(cè)定納米銀對(duì)副溶血弧菌的最小抑菌濃度（三）
2結(jié)果與討論
2.1 Ag NPs的特征
透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)表征結(jié)果顯示，本研究中合成的大部分Ag NPs接近球形，且在水中具有較好的分散性(圖2a)。隨機(jī)分析100個(gè)顆粒的粒徑(d,nm)，結(jié)果顯示，平均值為(37±5)nm(圖2b)。新制備的納米材料最大光吸收峰出現(xiàn)在415 nm左右(圖2c)，表現(xiàn)出Ag NPs的特征峰。該結(jié)果還表明，產(chǎn)物具有較好的形貌一致性和純度。
圖2 Ag NPs的TEM(右上角插圖：其在水中的分散液照片)(a)、粒度分布圖(b)和UV-vis光譜圖(c)
2.2 EMGA法測(cè)定結(jié)果
科研界常通過(guò)分析納米材料對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線的影響來(lái)推測(cè)該被分析物的抑菌效應(yīng)。研究首先以河口水樣S1作為代表探討了復(fù)雜介質(zhì)中Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的作用。在河口水樣S1中，10 5 CFU/mL的副溶血弧菌急性暴露于不同濃度的Ag NPs之后，暴露混合液直接轉(zhuǎn)入預(yù)裝有LB液體培養(yǎng)基的檢測(cè)管中，采用EMGA法測(cè)定存活細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果如圖3a所示。
Ag NPs濃度為0時(shí)(陽(yáng)性對(duì)照)，三平行實(shí)驗(yàn)皆得到了重現(xiàn)性良好的反正弦型生長(zhǎng)曲線，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)條件下存活細(xì)菌很多且正常、穩(wěn)定地增殖與生長(zhǎng)。當(dāng)河口水中Ag NPs濃度逐漸增大時(shí)，副溶血弧菌的生長(zhǎng)調(diào)整期隨之逐漸增加，直到出現(xiàn)直線型響應(yīng)線(表明新陳代謝活動(dòng)完全被抑制)。當(dāng)生理鹽水中Ag NPs濃度≥24.0 mg/L時(shí)，在該培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi)沒有反正弦型細(xì)菌生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)，根據(jù)國(guó)際通用規(guī)則，可以認(rèn)為在本實(shí)驗(yàn)條件下Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的MIC值為24.0 mg/L。為了驗(yàn)證EMGA法測(cè)定納米材料抑菌活性的重現(xiàn)性和精密度，在一周內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)3名成員采用完全相同的操作方法分別進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了Ag NPs在河口水樣品S1中對(duì)副溶血弧菌的MIC值，得到的MIC值皆為24.0 mg/L。該結(jié)果說(shuō)明EMGA法具有良好的精密度和重現(xiàn)性。作為對(duì)比，實(shí)驗(yàn)采用BMD法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定了相同條件下Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的抑制效應(yīng)，結(jié)果分別見圖3b和圖3c。
圖3 EMGA法(a)、BMD法(b)和平板計(jì)數(shù)法(c)測(cè)定AgNPs在河口水中對(duì)副溶血弧菌的抑制作用
由圖3可知，BMD法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定的MIC值也為24.0 mg/L，說(shuō)明采用EMGA法分析河口水中Ag NPs的抑菌效應(yīng)時(shí)，所得數(shù)據(jù)和采用經(jīng)典的BMD法和平板計(jì)數(shù)法所得數(shù)據(jù)具有良好的一致性。2.3 EMGA法性能分析實(shí)驗(yàn)采用EMGA法、BMD法和平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定了S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8共8個(gè)河口水樣品中Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的急性暴露影響，MIC值如表2所示。
結(jié)果表明，EMGA法測(cè)定結(jié)果和BMD與平板計(jì)數(shù)法測(cè)定的MIC值吻合性很好，基本符合(EA)達(dá)到75%；小偏差(mE)為25%，未發(fā)現(xiàn)大偏差(ME)，說(shuō)明EMGA法測(cè)定Ag NPs對(duì)副溶血弧菌抑菌效應(yīng)具有良好的準(zhǔn)確性。
此外，EMGA法測(cè)定的MIC值往往大于或等于BMD法和平板計(jì)數(shù)法的測(cè)定結(jié)果，其原因在于自動(dòng)化儀器的靈敏度高于肉眼觀察。因此，EMGA法的抑菌效應(yīng)測(cè)定結(jié)論比基于肉眼判斷的結(jié)果具有更高的可靠性。Zhang等研究表明，采用OD法測(cè)定模擬河口水中納米材料對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)的抑制效應(yīng)時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)OD-t曲線因受共存物質(zhì)光學(xué)信號(hào)的干擾而波動(dòng)嚴(yán)重，導(dǎo)致無(wú)法讀取MIC的準(zhǔn)確值。
本研究采用BMD法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定河口水樣中Ag NPs的抑菌效應(yīng)時(shí)也需要采用離心法除去懸浮顆粒等干擾物，否則嚴(yán)重影響MIC值的準(zhǔn)確讀取(如圖4所示)。由于MIC值和存活微生物的培養(yǎng)時(shí)間具有相關(guān)性，研究中培養(yǎng)時(shí)間全部采用20 h。
在這種情況下，如圖5所示，采用EMGA法測(cè)定河口水樣中Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的影響時(shí)僅需要兩步手工操作——將暴露后的混合物直接轉(zhuǎn)移到檢測(cè)管和上機(jī)測(cè)定存活細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，檢測(cè)總周期為1 210 min。而采用BMD法和平板計(jì)數(shù)法都需要3個(gè)步驟，檢測(cè)總周期為1 230 min。較之于經(jīng)典的方法，EMGA法需要的手工操作步驟較少，意味著耗時(shí)、勞動(dòng)力、費(fèi)用和誤差的降低，因此具有顯著的性能優(yōu)勢(shì)。
表2 EMGA法、BMD法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定的MIC值
注：—表示Ag NPs在0~48.0 mg/L范圍內(nèi)未抑制住細(xì)菌的生長(zhǎng)。
圖4未去除懸浮固體情況下河口水的BMD(a)和平板計(jì)數(shù)(b)結(jié)果圖像
圖5 EMGA法(上)和BMD、平板計(jì)數(shù)法(下)測(cè)定Ag NPs在河口水中抑菌效應(yīng)的流程和時(shí)效示意圖
3結(jié)論
本研究建立了一種測(cè)定Ag NPs在河口水中抑菌效應(yīng)的表型方法。該方法僅需要兩步手工操作：1)直接將暴露混合液加入預(yù)裝有LB液體培養(yǎng)基的檢測(cè)管中；2)把檢測(cè)管置入EMGA工作通道中測(cè)定存活細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線形狀即可判讀出該納米材料在河口水中對(duì)副溶血弧菌的MIC值。較之于經(jīng)典的測(cè)定方法(如BMD和平板計(jì)數(shù))，其優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需去除暴露混合液中諸如懸浮顆粒之類的復(fù)雜共存物，因此操作更簡(jiǎn)便、勞動(dòng)強(qiáng)度小，總周期縮短至少20 min。此外，由于手工操作步驟較少，有效地降低了主觀和客觀誤差風(fēng)險(xiǎn)。EMGA法測(cè)得的MIC值具有良好的精密度和重現(xiàn)性。同時(shí)，該基于傳感器識(shí)別結(jié)果的自動(dòng)化方法比BMD法和平板計(jì)數(shù)法具有更高的靈敏度。本研究為準(zhǔn)確、高效地測(cè)定納米材料在諸如河口水之類復(fù)雜介質(zhì)中的環(huán)境毒理效應(yīng)提供了新手段。
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