羅爾阿太菌生長曲線、原生質(zhì)體制備條件及融合技術（三）
2結果與分析
2.1羅爾阿太菌生長曲線
通過測定菌體生長曲線得知30——80 h菌體生長旺盛，為羅爾阿太菌生長對數(shù)生長期，此時制備原生質(zhì)體，可得到較高的原生質(zhì)體形成率和再生率。因此選用培養(yǎng)55 h的菌體用于原生質(zhì)體制備。
2.2原生質(zhì)體制備條件
2.2.1制備條件對原生質(zhì)體形成率和再生率的影響
由圖1a可知在添加單一種類酶中，第3組溶壁酶的去壁和再生效果最好，原生質(zhì)體的形成率為71.343%，再生率為9.003%.而第1組纖維素酶和第2組蝸牛酶的形成率和再生率都偏低。第4、5、6和7組復合酶的形成率和再生率都高于單一酶，尤其是第5組復合酶原生質(zhì)體的形成率為92.765%，再生率為18.869%，效果最好。
由圖1b可知隨著復合酶濃度的增加，原生質(zhì)體的形成率逐漸增加，再生率逐漸降低。原因可能是隨著復合酶濃度的增加，細胞壁與酶分子接觸機會增加，細胞壁被酶解的幾率增大，因此形成率增大。但當復合酶濃度過高時，不僅細胞壁被酶解，細胞膜也遭到嚴重破壞，致使原生質(zhì)體再生困難，造成再生率下降。當復合酶為3.1 mg·mL——1時，原生質(zhì)體的形成率為93.133%，再生率為18.932%，綜合效果較好。
由圖1c可知當溫度為30℃時，原生質(zhì)體的形成率最高，為92.767%.當溫度為32℃時，原生質(zhì)體再生率最高。這是由于酶在其最適溫度下才能發(fā)揮最高活力，溫度低，只能酶解部分細胞壁，原生質(zhì)體形成率和再生率都不高。溫度高不利于原生質(zhì)體的形成，導致形成率和再生率下降。考慮到原生質(zhì)體再生是原生質(zhì)體滅活的關鍵，溫度采用32℃。
由圖1d可知隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體形成率逐漸提高，而再生率逐漸下降。原因可能是酶解時間越長細胞壁被水解的越完全，使原生質(zhì)體形成率提高，但酶解時間過長時，酶在酶解細胞壁的同時也會損傷細胞膜，使原生質(zhì)體再生困難，導致原生質(zhì)體再生率下降，當酶解時間為55 min時，原生質(zhì)體形成率為92.134%，再生率為17.332%，綜合效果較好。
由圖1e可知，pH 5.5時原生質(zhì)體的形成率和再生率均達最大值。這可能是由于pH 5.5處于蝸牛酶（5.0——5.8）、纖維素酶（4.0——5.5）、溶壁酶（5.4——6.0）的適宜范圍內(nèi)，酶解效果好，因此原生質(zhì)體形成率和再生率最高。
圖1制備條件對原生質(zhì)體形成率和再生率的影響
由圖1f可知KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑破壁效果均優(yōu)于MgSO4、NaCl和蔗糖，原生質(zhì)體形成率和再生率分別為93.501%和18.867%.利用spss16.0軟件進行單因素方差分析，結果表明Sig為0.000，差異極顯著，按照顯著性水平P＜0.05分成3列（KCl、NaCl和蔗糖、MgSO4），三者之間有著顯著差異，其中NaCl和蔗糖之間差異不顯著。這可能是由于KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑更易避免原生質(zhì)體膨脹破裂。因此采用KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑進行原生質(zhì)體制備。
2.2.2原生質(zhì)體制備最佳條件的選擇
原生質(zhì)體制備正交試驗結果見表2.由表2可以看出，極差R的分布大小依次為復合酶濃度（A）＞酶解時間（C）＞酶解溫度（B）＞滲透壓穩(wěn)定劑（E）＞pH（D）。這表明復合酶濃度對原生質(zhì)體形成率和再生率影響最大，pH影響最小。原生質(zhì)體制備最佳組合條件為A2B2C3D2E3，即0.4 mol·L——1的KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，復合酶3.1 mg·mL——1，pH 5.5、32℃條件下酶解55 min，原生質(zhì)體形成率為93.534%，再生率為18.921%.
表2原生質(zhì)體制備正交試驗結果
2.3紫外滅活和熱滅活對原生質(zhì)體致死率的影響
紫外滅活和熱滅活對原生質(zhì)體致死率的影響如圖2所示，由圖2a可以看出隨著紫外照射時間的延長，原生質(zhì)體致死率升高。紫外照射5 min，原生質(zhì)體致死率達98.6%，照射6 min，原生質(zhì)體致死率達100%，因此6 min為紫外滅活最佳時間。
圖2紫外滅活和熱滅活對原生質(zhì)體致死率的影響
由圖2b可以看出，45℃熱處理60 min，55℃熱處理55 min，65℃熱處理40 min，原生質(zhì)體致死率均達100%.為了在最短時間內(nèi)達到滅活目的，選擇65℃熱處理40 min。
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