食品微生物檢驗(yàn)：菌落總數(shù)檢測結(jié)果不確定度的評定
食品微生物檢驗(yàn)對評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量、監(jiān)督食品安全有著尤為重要的作用，其結(jié)果的準(zhǔn)確性影響結(jié)果報(bào)告的判定。菌落總數(shù)定義為食品樣品經(jīng)過處理，在合理的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后，每克或每毫升食品檢樣中所生長出來的的微生物菌落總數(shù)。菌落總數(shù)是評價(jià)食品污染程度、儲(chǔ)存期以及安全性的衛(wèi)生指示菌。《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO/IEC 17025：2017）中明確指出實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備對測量結(jié)果進(jìn)行不確定度評定的能力。《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS-CL01-A001）也指出在微生物檢測中需要對不確定度做出合理評估。不確定度評定是評定結(jié)果可靠性的有效方法。
研究按照《測量不確定度的要求》（CNAS-CL01-G003）和JJF1059.1—2012[6]、GB/T 27418—2017對微生物檢驗(yàn)中菌落總數(shù)的檢測結(jié)果作不確定度評定。對菌落總數(shù)測定結(jié)果進(jìn)行不確定度評定是質(zhì)量控制的一部分，對于數(shù)據(jù)的可靠性、結(jié)果的符合性判定具有重要意義。
1材料與檢測方法
1.1測試樣品
本測量不確定度評定實(shí)例為單一樣品的重復(fù)測量，測試樣品為月餅。《月餅》（GB/T 19855—2015）[9]對菌落總數(shù)做出的要求為符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)糕點(diǎn)、面包》（GB 7099—2015）[10]，最高限量為104CFU/g，所以實(shí)驗(yàn)稀釋度取10-1與10-2。
1.2材料與設(shè)備
平板計(jì)數(shù)瓊脂（250 g，青島海博生物技術(shù)有限公司）；B級潔凈實(shí)驗(yàn)室；高壓蒸汽滅菌器（MSL.N，山東威高集團(tuán)）；凈化工作臺(tái)（SJ-CJ-2FD，蘇州蘇潔）；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z，上海博訊）。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1檢測依據(jù)
《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[1]。
1.3.2檢測過程
（1）無菌操作稱取25 g月餅于均質(zhì)袋中，加入225 mL生理鹽水進(jìn)行均質(zhì)，轉(zhuǎn)速8 000～10 000 r/min，時(shí)間2 min，制成10-1樣品勻液。
（2）吸取1 mL上述樣品勻液，沿試管壁加入1支無菌試管中（含9 mL生理鹽水），充分混勻，制成10-2樣品勻液。
（3）稀釋時(shí)在無菌平皿內(nèi)加入1 mL樣品勻液（2個(gè)平行），同時(shí)用無菌生理鹽水做空白對照。
（4）每皿傾注20 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（46℃左右），轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與樣液混合均勻。
（5）平板凝固后，倒置培養(yǎng)，溫度（36±1）℃，時(shí)間（48±2）h。
（6）結(jié)果觀察并計(jì)算。菌落計(jì)數(shù)范圍30～300 CFU/g。
2數(shù)學(xué)模型
（1）只有一個(gè)稀釋度（10-3）的菌落在可計(jì)數(shù)范圍，則，，例d=10-3。
（2）2個(gè)連續(xù)稀釋度（如10-2、10-3）的菌落在可計(jì)數(shù)范圍，則為：
式中：N檢樣中菌落總數(shù)，CFU/g；∑C平板菌落總數(shù)的和，CFU/g；n1低稀釋倍數(shù)平板個(gè)數(shù)；n2高稀釋倍數(shù)平板個(gè)數(shù)；d-稀釋因子（第一稀釋度），例d=10-2。
3不確定度的評定
菌落總數(shù)檢測的特點(diǎn)是數(shù)據(jù)結(jié)果的發(fā)散性很大，不是正態(tài)分布，而屬于偏態(tài)分布，因此直接通過結(jié)果平均值的計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法顯得不太合理。所以通常的做法是將結(jié)果取對數(shù)后，再用常規(guī)的貝塞爾方法進(jìn)行計(jì)算。
不確定度測量除各種系統(tǒng)因素的影響外，還包括隨機(jī)因素的影響[14]。微生物檢測不確定度一般來源于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、計(jì)量器具校準(zhǔn)及操作人員技能等。本研究對B類不確定度（樣品處理、稀釋、加樣體積）及A類不確定度（重復(fù)操作）進(jìn)行分析，見表1。
表1不確定度匯總表
3.1標(biāo)準(zhǔn)不確定度估算
3.1.1樣品處理相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度（urel（制備））
制備10-1樣品勻液，主要涉及稱取樣品時(shí)電子秤（使用1次）的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和量取生理鹽水時(shí)量筒（使用1次）的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。
根據(jù)天平制造商的說明書，該天平的分辨力d=0.1 g，區(qū)間半寬度為0.05 g，按矩形分布，按照樣品稱量取25.0 g；根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）得知250 mL量筒容量允許誤差為±2.0 mL，取矩形分布。則樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為：
3.1.2遞增稀釋相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度（urel（稀釋））
在制備樣品勻液時(shí)，主要由1 mL和10 mL移液器引入的不確定度，1 000μL和10 000μL移液器的容量允許誤差[18]分別為±10μL和±60μL，其中10 mL和1 mL移液器各用了1次。
3.1.3加樣體積相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度（urel（加樣））
吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，做2個(gè)平行，使用1 000μL移液器2次。加樣時(shí)相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：
3.1.4 A類重復(fù)測量引起的不確定度（urel（A））
按照試驗(yàn)方法對樣品平行測定10次，檢測數(shù)據(jù)見表2。具體計(jì)算如下。
表2單一樣品重復(fù)測量的計(jì)算過程
（1）每次測量結(jié)果均值xi。
（2）取對數(shù)lgxi，計(jì)算平均值
（4）數(shù)據(jù)結(jié)果為10次重復(fù)操作的平均值，則為：
3.2相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度
引起不確定度分量都是相對獨(dú)立的，則合成不確定度為：
依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[19]，由于置信概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得
3.3取反對數(shù)，由lgx坐標(biāo)回到x坐標(biāo)
由于lgx與x的非線性關(guān)系，不能直接求擴(kuò)展不確定度U的反對數(shù)[20]，只能給出微生物含量的可能區(qū)間。因此確定lgx的取值范圍為：lgx=3.542 3±0.149 2，即lgx的取值為3.393 1～3.691 5，再取反對數(shù)后可得2.5×103CFU/g≤x≤4.9×103CFU/g。
4僅A類重復(fù)測量引起的不確定度
在評定不確定度時(shí)，不考慮B類各種隨機(jī)影響引入的不確定度分量。10次重復(fù)測量的平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：
由于置信概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得k=2。
5結(jié)論
從不確定度計(jì)算結(jié)果可以看出，4種因素對測量結(jié)果均有影響，經(jīng)計(jì)算得出，這些分量可以忽略不計(jì)。B類不確定度分量對合成不確定度影響較小，A類重復(fù)測量帶來的不確定度分量最大，所以主要考慮重復(fù)操作引起的不確定度，即統(tǒng)計(jì)的A類評定測量不確定度是可行的。按照此方法進(jìn)行菌落總數(shù)的不確定度評定，可減少誤差，提高結(jié)果精確度，對測量指標(biāo)合格與否提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。
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