水貂腸道乳酸桿菌RSJ生長曲線及產(chǎn)酸、藥敏試驗結(jié)果（二）
1.2.8抑菌試驗
將致病性大腸桿菌和沙門氏菌分別接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)后，稀釋菌液濃度至0.5個麥?zhǔn)媳葷釂挝唬瑢⒁褱缇钠胀ㄅ囵B(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)(每皿15 mL)，待其凝固。此外，將融化的普通培養(yǎng)基冷卻到50℃左右加入致病菌株，將混有菌的培養(yǎng)基5 mL加到已凝固的培養(yǎng)基上待其凝固。然后以無菌操作在培養(yǎng)基表面垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，在杯中加入乳酸菌發(fā)酵液。置于37℃培養(yǎng)16～18 h，然后用測量抑菌圈直徑，計算其平均值。
1.2.9安全性試驗
選取體重18～22 g的昆明系小白鼠10只，隨機(jī)分組，每組5只。按3.6×108CFU/mL的劑量對空腹8 h后的試驗小鼠每天每次經(jīng)口灌胃0.3 mL，同時設(shè)空白對照組。每天觀察和記錄，14 d結(jié)束試驗后，剖檢觀察內(nèi)臟及其它組織器官有無變化。
2結(jié)果
2.1菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果
菌落形態(tài)為中央凸起、邊緣整齊、黃色或白色半透明狀菌落。鏡檢為革蘭氏陽性菌，菌體形態(tài)為桿狀，多數(shù)呈鏈條狀排列(如圖1)，命名為RSJ。
2.2生化試驗鑒定結(jié)果
分離菌的觸酶試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗等皆為陰性(見表1)，根據(jù)RSJ菌的菌落、鏡檢形態(tài)和生化試驗，參照文獻(xiàn)初步鑒定為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。
圖1 RSJ的菌落形態(tài)與革蘭染色鏡檢(×1000)
2.3 PCR鑒定結(jié)果
用乳酸桿菌屬特異性引物對菌株RSJ進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在223 bp處有特異性條帶(圖2)。
將分離的RSJ菌株的測序結(jié)果與其他17個從GenBank獲取的乳酸桿菌屬的核酸序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示比對的幾個菌株的同源性在91.2%～94.7%之間(圖3)，RSJ菌株被鑒定為乳酸桿菌屬。
2.4耐酸試驗結(jié)果
對RSJ菌株進(jìn)行不同pH生長情況試驗，判定試驗結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基底部是否有白色沉淀，如果有白色沉淀，搖動呈渾濁狀，說明菌株在此培養(yǎng)條件下能夠進(jìn)行繁殖生長。結(jié)果表明，pH 2.0和3.0時，培養(yǎng)液搖勻后清澈，菌株在此pH基本不生長；pH 4.0時，培養(yǎng)液微混，菌株生長，但生長不好；pH 5.0和6.0時，培養(yǎng)液底部的有白色沉淀，搖勻后渾濁，菌株生長良好(圖4)。
表1 RSJ的生化試驗鑒定結(jié)果
2.5生長曲線和產(chǎn)酸試驗
由圖5看出，菌株RSJ在6 h開始進(jìn)入對數(shù)期，前18 h菌株繁殖較快，OD600值持續(xù)生長，此時pH急速下降；從18～36 h，OD600值趨于平穩(wěn)在1.670，pH趨于3.98，菌株維持在穩(wěn)定期。
圖2菌株RSJ的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
圖3 RSJ與其他菌株核酸序列的同源性比較結(jié)果
圖4菌株RSJ的耐酸試驗結(jié)果0.不接菌對照；2-6.不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)；7.接菌對照
2.6藥敏試驗結(jié)果
用標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923(S.aureusATCC25923)作為質(zhì)控菌，試驗菌對抗生素的藥敏性參照WHO提供的NCCLS的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。對菌株進(jìn)行了藥敏試驗，得到菌株對16種抗生素的藥敏結(jié)果見表2。由表2知，菌株RSJ對青霉素、慶大霉素和環(huán)丙沙星等有一定的耐藥性，其中對青霉素和環(huán)丙沙星的耐藥性較強(qiáng)，對其余抗生素則表現(xiàn)為敏感。
2.7抑菌試驗結(jié)果
菌株RSJ對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為8.3 mm，對大腸桿菌的抑菌圈為9.5 mm。
圖5菌株RSJ的生長曲線和產(chǎn)酸曲線
2.8安全性試驗結(jié)果
經(jīng)14 d灌服觀察，小鼠生長狀況良好，無死亡現(xiàn)象；剖檢內(nèi)臟組織器官無肉眼可見異常變化，說明菌株RSJ對小鼠無毒性。
3討論
使用益生菌，首要問題是要考慮其定植性，活菌在體內(nèi)定植是極為復(fù)雜的，具有宿主種屬特異性。所以，篩選菌種時，應(yīng)盡量選用來自該動物屬宿主分離的正常菌群，這樣菌株進(jìn)入動物體內(nèi)才較易存活，并能與致病菌搶奪附著點，具有很強(qiáng)的競爭優(yōu)勢。本試驗采取健康成年母貂的新鮮腸粘膜和糞便，利用改良MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)，結(jié)合16S rRNA分子生物學(xué)鑒定，鑒定出1株乳酸桿菌RSJ，并對RSJ菌株的生長情況和安全性等生物特性進(jìn)行了研究。
表2 RSJ的藥敏試驗結(jié)果
注：R.耐藥；M.中敏；S.敏感。
傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法試驗周期長、工作量大、試驗結(jié)果依賴人的主觀判斷。近年來，逐步建立起來的16S rRNA序列分析方法，通過提取樣品中微生物的總DNA，直接從核酸水平對樣品進(jìn)行分析研究，為細(xì)菌的分類、鑒定提供了新的研究方法。據(jù)孫曉雯等報道，從豬糞便中分離得到一株新飼用乳桿菌，對其16S rDNA基因進(jìn)行了測序并進(jìn)行BLAST比對，和16S rDNA序列分析鑒定為約氏乳桿菌。陳麗園等通過對菌體形態(tài)特征、菌落特征和生理生化特性的分析，最終將1株抗雞沙門氏菌的乳酸菌歸類為乳酸乳桿菌亞軍。
從水貂體內(nèi)分離到的菌種制成微生態(tài)制劑對促進(jìn)水貂的生長會有較為明顯的效果。本試驗分離的菌株來自健康的水貂腸道，理論上講，能夠很好地適應(yīng)水貂腸道。本試驗只對乳酸桿菌進(jìn)行了屬的鑒定，還需要對其進(jìn)行種鑒定，以及對其在水貂上的安全性試驗以及效果等方面有待于進(jìn)一步研究。
4結(jié)論
從水貂腸道分離的1株優(yōu)勢菌株(RSJ)，為乳酸桿菌屬。RSJ在10 h進(jìn)入對數(shù)期，前22 h菌株繁殖較快，pH急速下降；22～36 h，菌株維持在穩(wěn)定期；其對青霉素和環(huán)丙沙星的耐藥性較強(qiáng)；對小白鼠安全無毒，且對酸環(huán)境有一定的耐受性，其代謝產(chǎn)物對致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，具備了益生菌的基本條件。
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