納米材料Cu2-xSe NCs可在1 h內(nèi)殺死所有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌、革蘭氏陽(yáng)性菌
2結(jié)果與討論
2.1硒化銅納米晶體的表征
用水熱法合成的Cu2-xSe NCs分散均勻且粒徑均一，約為12.8 nm，因其獨(dú)特的銅缺陷結(jié)構(gòu)而在近紅外區(qū)具有強(qiáng)烈的局域表面等離子體共振吸收。此外，由于所用包被劑為CTAB，所以該Cu2-xSe NCs表面帶正電。Cu2-xSe NCs的表征結(jié)果見圖2。
圖2 Cu2-xSe NCs的表征。(A)Cu2-xSe NCs的透射電鏡(TEM)圖像;(B)Cu2-xSe NCs的粒度分布，其通過在視野中隨意計(jì)數(shù)100個(gè)顆粒而獲得;(C)Cu2-xSe NCs的UV-Vis吸收光譜；(D)Cu2-xSe NCs和H2O的Zeta電位
2.2硒化銅納米晶體對(duì)常見致病菌的抗菌活性
本實(shí)驗(yàn)從Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli和S.aureus的細(xì)菌存活率、MIC和MBC三個(gè)方面考察其抗菌活性。如圖3所示，隨著Cu2-xSe NCs濃度的增加，無論是E.coli還是S.aureus，其細(xì)菌存活率都逐漸下降。此外，Cu2-xSe NCs對(duì)S.aureus的影響明顯強(qiáng)于對(duì)E.coli的影響。對(duì)于E.coli，當(dāng)Cu2-xSe NCs的濃度為32μg/mL時(shí)，細(xì)菌存活率為0，即無細(xì)菌生長(zhǎng)，而對(duì)于S.aureus，只需4μg/mL的Cu2-xSe NCs已可以抑制其生長(zhǎng)。Cu2-xSe NCs對(duì)常見致病菌的MIC測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。因MIC是指引起細(xì)菌肉眼觀察下未見生長(zhǎng)的藥物最低濃度，故我們選擇肉眼可見細(xì)菌培養(yǎng)液澄清透明的EP管對(duì)應(yīng)的Cu2-xSe NCs濃度為該材料的MIC。如圖4所示，Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli的MIC為32μg/mL，對(duì)S.aureus的MIC為4μg/mL。這一現(xiàn)象也和其細(xì)菌存活率結(jié)果一致。
圖3 Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli(A)和S.aureus(B)細(xì)菌存活率的影響
圖4 Cu2-xSe NCs對(duì)常見致病菌的MIC(Cu2-xSe NCs濃度單位為μg/mL)
以MIC為界，將MIC及其后未長(zhǎng)菌試管和MIC的前一個(gè)試管中的培養(yǎng)液取200μL轉(zhuǎn)移到干凈的固體LB培養(yǎng)基上，涂板并在37℃全溫?fù)u床中孵育12 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，結(jié)果見圖5。對(duì)于E.coli，Cu2-xSe NCs的最小殺菌濃度MBC為32μg/mL，而對(duì)于S.aureus，Cu2-xSe NCs的最小殺菌濃度MBC則為4μg/mL。
圖5 Cu2-xSe NCs對(duì)常見致病菌的MBC
2.3硒化銅納米晶體對(duì)耐藥菌株的抗菌活性
圖6 Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli耐藥菌株(A)和S.aureus耐藥菌株(B)細(xì)菌存活率的影響
考察了Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的抗菌活性，其內(nèi)容為Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli耐藥菌株和S.aureus耐藥菌株的細(xì)菌存活率、MIC和MBC三個(gè)方面。如圖6所示，Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株細(xì)菌存活率的影響和對(duì)其普通菌株的影響相似，對(duì)于E.coli耐藥菌株，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為32μg/mL時(shí)，細(xì)菌存活率為0，而對(duì)于S.aureus耐藥菌株，只需4μg/mL Cu2-xSe NCs。
Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的MIC也和對(duì)其普通菌株的MIC一致，對(duì)于E.coli耐藥菌株和S.aureus耐藥菌株，MIC分別為32μg/mL和4μg/mL(圖7)。而Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的最小殺菌濃度MBC則不太相同(圖8)。對(duì)于E.coli耐藥菌株，Cu2-xSe NCs的MBC為32μg/mL，對(duì)于S.aureus耐藥菌株，Cu2-xSe NCs的MBC為8μg/mL，和Cu2-xSe NCs對(duì)S.aureus普通菌株的MBC 4μg/mL相比，略高。
圖7 Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的MIC(Cu2-xSe NCs濃度單位為μg/mL)
圖8 Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的MBC
2.4硒化銅納米晶體的抑菌動(dòng)力學(xué)
為了探究Cu2-xSe NCs對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的的抑菌動(dòng)力學(xué)，我們測(cè)定了細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和時(shí)間-殺菌曲線。如圖9所示，對(duì)于E.coli，細(xì)菌在孵育2 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，直至12 h后進(jìn)入平臺(tái)期。隨著Cu2-xSe NCs濃度的逐漸增加，雖然細(xì)菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)并未改變，但是增長(zhǎng)速度逐漸減小，當(dāng)其濃度為16μg/mL時(shí)，細(xì)菌在孵育8 h后才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并于12 h后進(jìn)入平臺(tái)期；而當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度增加到32μg/mL時(shí)，即達(dá)到MIC時(shí)，細(xì)菌不再生長(zhǎng)。對(duì)于S.aureus，細(xì)菌在孵育1 h后就開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入平臺(tái)期。并且S.aureus受Cu2-xSe NCs濃度影響更大，隨著其濃度的逐漸增加，細(xì)菌的增長(zhǎng)速度大幅降低。當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度到達(dá)MIC時(shí)，細(xì)菌基本不生長(zhǎng)。再一次證明了S.aureus對(duì)Cu2-xSe NCs更敏感。
圖9 Cu2-xSe NCs抑制常見致病菌的生長(zhǎng)曲線
時(shí)間-殺菌曲線可以評(píng)估一種抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的殺菌速率。我們?nèi)u2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖10)。對(duì)于E.coli，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為0或者0.5倍MIC時(shí)，細(xì)菌數(shù)目持續(xù)增長(zhǎng)，但當(dāng)其濃度到達(dá)32μg/mL，即Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli最小殺菌濃度MBC時(shí)，細(xì)菌在1 h內(nèi)全部死亡。對(duì)于S.aureus，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為0時(shí)，細(xì)菌不斷生長(zhǎng)，但隨著其濃度的增加，細(xì)菌逐漸減少，當(dāng)其到達(dá)Cu2-xSe NCs對(duì)S.aureus最小殺菌濃度的MBC(4μg/mL)時(shí)，細(xì)菌在8 h內(nèi)全部死亡。伴隨著Cu2-xSe NCs濃度的不斷增大，細(xì)菌死亡時(shí)間愈來愈短，當(dāng)其為32μg/mL時(shí)，細(xì)菌在1 h內(nèi)全部死亡。即，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為32μg/mL時(shí)，不管是革蘭氏陽(yáng)性菌還是革蘭氏陰性菌，都會(huì)在1 h內(nèi)全部死亡，證明了Cu2-xSe NCs擁有較強(qiáng)的殺菌性能。
圖10 Cu2-xSe NCs抑制常見致病菌的時(shí)間-殺菌曲線
圖11 Cu2-xSe NCs中Cu2+的釋放曲線
2.5硒化銅納米晶體的抗菌機(jī)制
在抗菌劑抗菌機(jī)制研究中，較為公認(rèn)的有四種途徑：其一，金屬離子接觸反應(yīng)，這也是無機(jī)抗菌劑最普遍的抗菌作用機(jī)理；其二，催化激活機(jī)理，即通過催化產(chǎn)生活性氧物質(zhì)從而殺死細(xì)菌；其三，陽(yáng)離子固定機(jī)理，即抗菌劑攜帶陽(yáng)離子基團(tuán)，以此固定負(fù)電荷的細(xì)菌，從而使其接觸性死亡并破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜；其四，細(xì)胞內(nèi)容物、酶、蛋白質(zhì)、核酸損壞機(jī)理，這是許多有機(jī)抗菌劑的抗菌機(jī)理。為考察Cu2-xSe NCs的抗菌機(jī)制，我們首先測(cè)定Cu2-xSe NCs中Cu2+的釋放曲線(圖11)，不斷增加的Cu2+濃度證明了Cu2-xSe NCs可以持續(xù)釋放Cu2+，從而實(shí)現(xiàn)持久抗菌的作用。其次，我們使用了活性氧(ROS)熒光探針DCFH-DA，并通過熒光共聚焦分析Cu2-xSe NCs與細(xì)菌作用是否有活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)Cu2-xSe NCs并不會(huì)產(chǎn)生ROS，即不是通過催化激活機(jī)理殺死細(xì)菌。Zeta電位(圖2D)證實(shí)Cu2-xSe NCs因其包被劑為CTAB，一種帶季胺鹽基團(tuán)的陽(yáng)離子表面活性劑而帶正電，證明Cu2-xSe NCs可通過陽(yáng)離子固定機(jī)理實(shí)現(xiàn)殺菌。最后我們考察了細(xì)胞內(nèi)容物、酶、蛋白質(zhì)、核酸損壞機(jī)理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Cu2-xSe NCs并不能通過該途徑滅菌。
綜上所述，Cu2-xSe NCs的殺菌性能主要依靠金屬離子接觸反應(yīng)和陽(yáng)離子固定機(jī)理實(shí)現(xiàn)。
3結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Cu2-xSe NCs擁有較強(qiáng)的殺菌性能，對(duì)常見的E.coli(革蘭氏陰性菌)和S.aureus(革蘭氏陽(yáng)性菌)表現(xiàn)出殺菌活性，并且對(duì)其耐藥菌株具有良好抑菌能力，而S.aureus對(duì)Cu2-xSe NCs更為敏感，這是由于E.coli具有雙層膜而S.aureus僅擁有單層膜。此外，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為32μg/mL時(shí)，不管是革蘭氏陽(yáng)性菌還是革蘭氏陰性菌，都會(huì)在1 h內(nèi)全部死亡，證明了Cu2-xSe NCs擁有較強(qiáng)的殺菌性能。因此，在新型抗菌藥的研究中，納米材料Cu2-xSe NCs具有成為新型抗菌劑的潛力。
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