雞印第安納株沙門(mén)菌生長(zhǎng)、致病性及藥物敏感性研究（三）
2.2細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定
分離株在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖3所示，SM24在培養(yǎng)2 h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在3~6 h細(xì)菌增殖速度最快，從8 h開(kāi)始生長(zhǎng)逐漸減緩，進(jìn)入穩(wěn)定期;培養(yǎng)12 h后菌液OD600值不再增加，活細(xì)菌含量緩慢下降，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期。說(shuō)明分離菌株SM24在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，具有典型的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。
圖3分離菌株SM24的菌液OD600值(A)和活細(xì)菌含量(B)生長(zhǎng)曲線
2.3毒力測(cè)定
SM24分離株不同劑量對(duì)3日齡SPF雛雞進(jìn)行攻毒，1.5×107 CFU攻毒組雛雞在5 d內(nèi)全部死亡，1.5×106 CFU組死亡5只，1.5×105 CFU組死亡2只，其他接種組無(wú)死亡，對(duì)照組雛雞狀態(tài)良好。表明分離株對(duì)雛雞具有致病性，經(jīng)Probit回歸計(jì)算SM24的LD50為8.50×105 CFU。
2.4耐藥性檢測(cè)
分離株SM24的藥物敏感性測(cè)定結(jié)果如表2所示，SM24對(duì)大觀霉素、阿米卡星、氯霉素、氟苯尼考、亞胺培南和多黏菌素B這6種抗生素敏感;對(duì)呋喃唑酮中介;對(duì)青霉素類(氨芐西林、阿莫西林)、頭孢菌素類(頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢曲松)、喹諾酮類(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)、四環(huán)素類(多西環(huán)素、四環(huán)素)、磺胺類(復(fù)方新諾明、甲氧芐啶)以及新霉素、慶大霉素、阿奇霉素和氨曲南這16種抗生素表現(xiàn)耐藥。以上結(jié)果說(shuō)明分離株SM24屬于多重耐藥性菌株，抗生素耐藥譜極廣。
表2分離菌株藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果
2.5全基因組測(cè)序
對(duì)分離株SM24進(jìn)行全基因組測(cè)序(見(jiàn)圖4、5)，獲得其全基因組大小為4 865 511 bp，GC含量為51.96%。基因組包含1個(gè)完整的細(xì)菌染色體序列和1個(gè)完整的質(zhì)粒序列，其中染色體序列大小為4 700 467 bp，質(zhì)粒大小為165 044 bp，質(zhì)粒命名為pASM-1。質(zhì)粒類型分析顯示，pASM-1為IncHI2質(zhì)粒，包含IncHI2和IncHI2A兩個(gè)復(fù)制子。基因組序列共有4 635個(gè)編碼蛋白的基因，含有108個(gè)非編碼RNA序列，包括86個(gè)tRNA、8個(gè)5S rRNA、7個(gè)16S rRNA和7個(gè)23S rRNA，并且存在2個(gè)CRISPR元件(CRISPR1和CRISPR2)和10個(gè)前噬菌體序列。
2.6全基因組序列分析
2.6.1血清型比對(duì)與數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)SeqSero 1.2數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，顯示分離株SM24的O抗原為O4，H1抗原為z，H2抗原為1，7，血清型確定為印第安納沙門(mén)菌。對(duì)基因組序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋結(jié)果見(jiàn)表3，其中NR注釋的序列為4 460條、GO注釋的序列為2 762條、eggNOG注釋3 809條、KEGG注釋3 208條、Swiss注釋3 809條、CARD注釋144條、VFDB注釋280條。
圖4分離菌株SM24的基因組圈圖
圖5 pASM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圈圖
表3基因功能注釋統(tǒng)計(jì)條
2.6.2整合接合元件(ICE)預(yù)測(cè)
通過(guò)ICEfinder預(yù)測(cè)，在分離株基因組中存在一個(gè)ICE，位置在染色體2 684 249~2 727 127，大小為42 879 bp，預(yù)測(cè)為整合移動(dòng)元件(IME)，包含aatL和attR兩個(gè)整合位點(diǎn)。
2.6.3 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
SM24分離株基因組的GO注釋顯示，共有2 762個(gè)基因序列獲得注釋，占總編碼蛋白序列的59.59%。GO注釋的基因包含三大分類和38個(gè)二級(jí)分類(圖6)，其中大類包括生物過(guò)程(biologicalprocess)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)，二級(jí)分類包括代謝過(guò)程(metabolic process)、生物黏附(biological adhesion)、胞內(nèi)成分(intracelluar)、蛋白復(fù)合物(protien-con?taining complex)、催化活性(catalytic activity)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)等生命過(guò)程。
圖6 SM24基因組序列GO功能分類圖
2.6.4毒力基因分析
通過(guò)VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株SM24共注釋到280個(gè)毒力基因，編碼的產(chǎn)物主要參與分泌系統(tǒng)、菌毛黏附、鐵攝取、免疫逃避等(圖7)。其中與細(xì)菌分泌系統(tǒng)相關(guān)的注釋基因共79條，占28.21%，主要包括毒力島1(SPI1)和毒力島2(SPI2)基因編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)以及由Hcp分泌島1(HSI-I)和沙門(mén)菌中心島(SCI)基因編碼的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS);與細(xì)菌黏附有關(guān)的菌毛黏附?jīng)Q定因素和運(yùn)動(dòng)性侵襲黏附相關(guān)毒力基因分別注釋61條和46條，共占38.21%;鐵攝取相關(guān)毒力基因注釋了22條，其中包含典型的沙門(mén)菌素合成與轉(zhuǎn)運(yùn)基因(iroBCDEN)、腸桿菌素的合成(entABC?DEF)和轉(zhuǎn)運(yùn)(fepBCDG)相關(guān)毒力基因;編碼脂多糖(lpxAC、gtrAB等)和莢膜等與免疫逃避的毒力基因有17條。除此之外，還有與細(xì)菌入侵(invAC、orgAB等)、黏附(fimACDFH)、營(yíng)養(yǎng)因子(allAB?CDRS)等多種毒力相關(guān)基因。
圖7 SM24分離株毒力基因統(tǒng)計(jì)
2.6.5耐藥基因分析
通過(guò)CARD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，SM24株基因組序列中共辨別出144條耐藥基因，其中133條位于細(xì)菌染色體上，11條位于pASM-1質(zhì)粒上。所有耐藥基因中，與多重耐藥相關(guān)的基因?yàn)?3條，占64.58%。對(duì)耐藥機(jī)制分類發(fā)現(xiàn)，與抗生素外排泵相關(guān)基因有62條，與抗生素靶點(diǎn)改變的基因有53條，除此之外還有與抗生素失活(14條)、抗生素滲透性降低(9條)、抗生素靶點(diǎn)保護(hù)和替代(各2條)等相關(guān)的耐藥基因(圖8)。IME和質(zhì)粒等均屬于細(xì)菌基因組可移動(dòng)元件，常攜帶耐藥基因，導(dǎo)致耐藥性的快速傳遞。對(duì)SM24染色體上IME位點(diǎn)和pASM-1質(zhì)粒上攜帶的耐藥基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。
染色體IME位點(diǎn)存在一個(gè)OmpK37耐藥基因，其與耐頭孢菌素類抗生素等多重耐藥性有關(guān);pASM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)上攜帶與耐受四環(huán)素類(tetA、tetR)、磺胺類(sul1)、利福平類(arr-3)、氯霉素類(catB3)、頭孢菌素類(OXA-1)、喹諾酮類(aac(6′)-Ib-cr)、氨基糖苷類(aac(3′)-Iid、aph(3)-Ia)、大環(huán)內(nèi)酯類(mphA)和磷霉素類(FosA3)藥物相關(guān)的基因。
圖8 SM24分離株不同耐藥機(jī)制耐藥基因統(tǒng)計(jì)
表4 SM24染色體IME和pASM-1質(zhì)粒攜帶的耐藥基因
2.7比較基因組分析
菌株SM24和國(guó)內(nèi)分離的6株雞源印第安納沙門(mén)菌參考基因組的共有和特有基因分析結(jié)果見(jiàn)圖9A，7個(gè)菌株共有基因有3 856條，分離株SM24的特有基因最多為365條，廣州分離株FJC33(CP041699.1)的特有基因有68條，江蘇分離株YZ21MCS4(CP089313.1)和XZ14C1328(CP102827.1)分別擁有32和18條特有基因，四川分離株JT01(CP028131.1)和北京分離株D90(CP022450.1)均有1條特有基因，上海分離株SJTUF13520v2(CP041181.1)未見(jiàn)特有基因。菌株進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果顯示(圖9B)，SM24菌株與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)分離的雞源印第安納沙門(mén)菌分離株不在同一進(jìn)化分支，說(shuō)明其與國(guó)內(nèi)分離的6個(gè)參考菌株的遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。注:?本研究分離菌株。
圖9分離株SM24與參考菌株的共有和特有基因分析(A)和基因組進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(B)
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