滸苔多糖降解微生物采集、分離、篩選、鑒定及生長曲線測定（二）
1.2滸苔多糖的提取
采取已建立的熱水浴加乙醇沉降的方法提取滸苔多糖，具體步驟為：將滸苔清洗干凈后，取適量于無菌水中，置于90℃水浴鍋水浴7 h，收集液體，重復操作2次。將所得液體離心（4 800g（g為重力加速度），15 min）去雜質后濃縮至50 mL。加1/5提取液體積的氯仿正丁醇溶液（氯仿∶正丁醇=5∶1）劇烈震蕩30 min后離心，取水相，去除提取液中的蛋白質，重復3次至無白色沉淀，收集上清液。將收集的液體用3倍體積的無水乙醇沉降，離心去上清，待干燥后加入適量無菌雙蒸水溶解備用。
1.3滸苔多糖降解微生物的篩選
將提取的滸苔多糖以5 g/L的終濃度加入無碳的海洋無機鹽培養基（minimum marine medium，MMM）中，該培養基含有25.95 g NaCl，2 g MgCl2·6H2O，3 g MgSO4·7H2O，0.12 g CaCl2·2H2O，27 mL 0.5 mol/L Na2EDTA，25 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH=8），10 mL 1 mol/L NH4Cl，0.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4，0.015 g FeSO4·7H2O，0.03 g H4MoNa2O6，1 mL微量元素混合液（含H3BO3 2.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.86 g/L，Zn SO4·7H2 O 0.22 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.39 g/L，CuSO4·5H2O 0.08 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0.05 g/L）和1 mL 1 000*維生素混合物。將分離到的菌株接種到以滸苔多糖為唯一碳源的MMM液體培養基中，28℃、200 r/min震蕩培養，根據生長情況判斷各菌株對滸苔多糖的利用能力，篩選出能利用滸苔多糖的菌株。同時，按照BIOLOG使用方法，用PM2A碳源利用板測試幾株菌對PM2A板上各碳源的利用情況。
1.4滸苔多糖降解菌的生長曲線測定
為了測試篩選出的滸苔多糖降解菌株A1-6和S7對滸苔多糖的利用能力及對其他碳源的利用情況，用2216E液體培養基加上滸苔多糖及其他碳源測試菌株的生長曲線及碳源利用譜。除滸苔多糖外，測試的碳源有：葡萄糖、α-乳糖、D-果糖、D-麥芽糖、D-半乳糖、蔗糖、木聚糖、糊精、可溶性淀粉及明膠。配制以上各種糖的儲備液，質量濃度為20 g/L。所用糖溶液經121℃、15 min高溫蒸汽滅菌后使用。取保存的A1-6和S7菌種，用2216E液體培養基培養，轉接3代活化。取15 mL無菌培養管，每管加入2216E培養基9 mL，待測糖儲備液1 mL（終質量濃度為2 g/L），接種菌液1 mL。以不加糖儲備液的培養物作為對照。每組培養物各重復做3次。用丹麥Biosense微生物生長動態監測系統掃描計算培養物在600 nm下的OD值。
2結果分析
2.1采樣點滸苔綠潮的情況
2020年2月廣西北海爆發了滸苔綠潮。圖1（a）為廣西北海金海灣海域的綠藻，發現引發此次綠潮的綠藻主要有2種：絲狀的滸苔及片狀的滸苔。2021年7月，山東青島爆發了滸苔綠潮，圖1（b）為山東青島棧橋海域的綠藻，引發此次綠潮的綠藻主要為絲狀滸苔。
2.2北海及青島樣品分菌結果分析
北海樣品分離的微生物鑒定結果見表1。北海樣品中共分離到13種菌，其中海水樣品中有8種，絲狀滸苔附著菌分離到7種，片狀滸苔附著菌分離到4種（3個樣品中分離到的菌株存在部分重復，如交替單胞菌Alteromonas macleodii和Alteromonas oceani在3個樣品中都分離到；Polaribacter marinaquae和Maribacter dokdonensis分別在2個樣品中都有分離到）。共分離到3種黃桿菌：Polaribacter marinaquae、Maribacter dokdonensis、Cellulophaga lytica。其中，在海水及片狀滸苔上有分離到Polaribacter marinaquae（片狀滸苔上4次都分離到），絲狀滸苔上沒有分離到Polaribacter marinaquae；在片狀滸苔上和絲狀滸苔上都有分離到Maribacter dokdonensis（絲狀滸苔上2次分離到），海水中沒有分離到Maribacter dokdonensis；只在絲狀滸苔上分離到1株Cellulophaga lytica。
青島樣品分離的微生物鑒定結果見表2。青島樣品中共分離到22種菌，其中海水樣品中有10種，絲狀滸苔附著菌分離到12種，共分離到4種黃桿菌：Meridianimaribacter flavus、Tenacibaculum geojense、Tenacibaculum mesophilum和Algibacter lectus，4株都是在絲狀滸苔上分離到的，海水中沒有分離到。對比2個采樣點的分菌結果，只有Alteromonas confluentis在北海和青島樣品中都有分離到。其他菌株均不相同，包括2個樣點分離到的黃桿菌也不相同。
在菌株鑒定的基礎上，對重點分析的5株菌：菌株A1-6、S7、A2-2、aA1-7和aA1-9構建了基于16S rRNA基因序列的系統發育樹（見圖2）。從圖2可見，菌株A1-6與Alteromonas confluentis親緣關系最近，聚成一支，且屬于γ變形菌（γ-proteobacteria）。菌株S7、aA1-7、aA1-9、A2-2分別與Algibacter lectus、Cellulophaga lytica、Maribacter dokdonensis和Polaribacter marinaquae聚成一支，都隸屬于黃桿菌（Flavobateria）。
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