五種常用抗真菌藥物對(duì)198株白色念珠菌最低抑菌濃度【藥敏試驗(yàn)】
白色念珠菌(Candida albicans，CA)是最常見的一種條件致病性真菌，大多發(fā)生在機(jī)體免疫力低下或菌群失調(diào)時(shí)，如腫瘤、慢性消耗性疾病、長(zhǎng)期大量使用廣譜抗生素、免疫抑制劑和激素等過程中易發(fā)生感染白色念珠菌，深部白色念珠菌感染的病死率高達(dá)68.90%。用常規(guī)培養(yǎng)的方法繁瑣且費(fèi)時(shí)，漏檢率也很高。因此，快速、準(zhǔn)確地從臨床標(biāo)本中直接檢出白色念珠菌對(duì)于疾病的早期診斷和治療以及對(duì)該病的流行病學(xué)調(diào)查亦有十分重要的意義。我們從2005年到2008年在臨床病例中分離了198株白色念珠菌，采用聚合酶鏈反應(yīng)(nested PCR，nPCR)從臨床標(biāo)本中直接檢測(cè)白色念珠菌，取得了良好的效果。目前，白色念珠菌對(duì)臨床上常用的幾種抗真菌藥物的耐藥率已達(dá)到相當(dāng)高的比例，這給臨床上抗真菌感染治療帶來一定困難。為了解白色念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性，以便為臨床正確選擇抗真菌藥物和有效控制白色念珠菌引起的感染提供依據(jù)，我們測(cè)定了五種常用抗真菌藥物對(duì)198株白色念珠菌最低抑菌濃度(MIC)，現(xiàn)報(bào)告如下。
1材料與方法
1.1臨床分離菌株來源白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CA16為本實(shí)驗(yàn)室保存，臨床分離菌株共339份，包括痰液109份，尿液85份，陰道拭子78份，咽拭子20份，創(chuàng)面分泌物19份，腹水8份，胸水6份，血液9份，腦脊液5份。以上標(biāo)本均來自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。
1.2模板液制備挑取純菌落混勻后置于55℃1 h，煮沸5 min，取出后1000 rpm離心30 s，上清即為擴(kuò)增的模板液。臨床標(biāo)本處理:尿液、腦脊液、胸水、腹水等液體標(biāo)本可直接取1ml備用，抗凝的血液直接吸取1 ml備用，拭子類標(biāo)本應(yīng)先置拭子于1-2 ml生理鹽水中充分洗脫后，吸取1 ml備用。
1.3引物設(shè)計(jì)白色念珠菌種特異性引物系從內(nèi)轉(zhuǎn)錄2區(qū)(internaltranscribedspacer-2，ITS-2)中選擇，CAF:5'-AACTTGCTTTGGCGGTGGGG-3';CAR:5'-TGGACGTTACCGCCGCAAGCC-3'，目標(biāo)堿基長(zhǎng)度為386 bp，引物由大連寶生物合成。
1.4 PCR檢測(cè)
用引物CAF和CAR，以各菌株為模板，反應(yīng)體系為:10×ExTaq Buffer，2.5μl;dNTP(10 mM)，0.5μl;CAF/CAR，各0.5μl;ExTaq酶，0.25μl;Template，1μl;ddH2O，19.75μl;總體積，25μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，1%瓊脂糖凝膠電泳。
1.5測(cè)OD值、活菌計(jì)數(shù)
在超凈工作臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)挑取單菌落接種于5ml改良沙堡氏液體培養(yǎng)基的試管中，置30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的菌液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并用滅菌改良沙堡氏液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為5×104CUF/ml。
用移液器分別吸取上述10μl接種菌液加入300 ml改良沙堡氏液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，從培養(yǎng)0 h時(shí)起及以后，每隔2 h取菌測(cè)OD530值。
1.6藥敏試驗(yàn)
取150μl菌液加入藥敏培養(yǎng)基，混勻后取150μl加入藥敏試驗(yàn)孔，30℃濕盒培養(yǎng)20 h-24 h后加顯色劑，繼續(xù)培養(yǎng)12 h-24 h后讀取藥敏結(jié)果。
2結(jié)果
2.1臨床標(biāo)本白色念珠菌PCR檢測(cè)
339份臨床標(biāo)本包括痰、尿、咽拭子、血液等，PCR檢出結(jié)果顯示從痰標(biāo)本中分離出的白色念珠菌最多77株占70.2%，其次是陰道拭子53株占67.4%，具體分布情況見表1，部分標(biāo)本的PCR電泳圖見圖1，擴(kuò)增出目的片段大小386 bp，與預(yù)期片段大小一致，其中5號(hào)泳帶為陽性對(duì)照，6號(hào)泳帶為陰性對(duì)照，其他3份標(biāo)本均為白色念珠菌。
表1臨床標(biāo)本白色念珠菌PCR檢測(cè)結(jié)果
2.2白色念珠菌生長(zhǎng)速率實(shí)驗(yàn)
在培養(yǎng)條件不變的情況下，每2 h取樣測(cè)定其在530 nm處的OD值，然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)可形成一條生長(zhǎng)曲線。白色念珠菌生長(zhǎng)的遲緩期為0-16 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為16-30 h，之后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰退期。生長(zhǎng)曲線如圖2:
圖1 PCR電泳圖
2.3白色念珠菌藥敏試驗(yàn)
對(duì)198株白色念珠菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，藥物敏感性由高到低為:氟胞嘧啶(92%)、兩性霉素(87.9%)、制霉素(85.4%)、酮康唑(29.8%)、咪康唑(18.7%)、伊曲康唑(14.1%)、氟康唑(5%);耐藥性由低到高為:氟胞嘧啶(2.5%)、制霉素(5%)、兩性霉素(8%)、酮康唑(8.6%)、咪康唑(39.9%)、伊曲康唑(45%)、氟康唑(75.8%)，見表2。
圖2白色念珠菌生長(zhǎng)曲線
表2 198株白色念珠菌藥敏表
3討論
白色念珠菌是引起臨床上深部真菌感染常見的病原菌，80%以上AIDS患者受真菌尤其是白念珠菌感染比較常見，深部真菌感染已成為許多疾病的主要死亡原因之一。所以從基因水平上檢測(cè)白色念珠菌是近年研究的熱門，基因檢測(cè)方法具有快速、高特異性、高敏感性等優(yōu)點(diǎn)，相信基因檢測(cè)技術(shù)一定能廣泛用于臨床。
本實(shí)驗(yàn)中我們用PCR技術(shù)對(duì)臨床標(biāo)本339份白色念珠菌進(jìn)行檢測(cè)，檢出白色念珠菌198株，檢出率為54%。檢出率高的原因是由于這些患者年老、體弱、病重、抗生素大量使用，使機(jī)體免疫力下降，導(dǎo)致體內(nèi)微生態(tài)平衡紊亂，從而使條件致病性真菌特別是白色念珠菌大量繁殖。有學(xué)者認(rèn)為抗生素是直接促進(jìn)真菌生長(zhǎng)和毒性作用發(fā)揮的主要因子。抗生素的不合理應(yīng)用是促使真菌生長(zhǎng)的重要因素，因此合理應(yīng)用抗生素十分關(guān)鍵。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，白色念珠菌感染多見于呼吸道和泌尿道，它在痰標(biāo)本檢出率最高，檢出率為70.2%;其次是尿液標(biāo)本，檢出率為67.4%。白色念珠菌作為正常菌群的一部分，在人的呼吸道和腸道少量存在，當(dāng)人的免疫防疫系統(tǒng)由于疾病或呼吸機(jī)、氣管插管、留置導(dǎo)尿管等醫(yī)源性因素而損害，引起繼發(fā)性感染，從而引起痰檢率或尿檢率白色念珠菌的升高。
細(xì)菌的生長(zhǎng)指細(xì)菌有規(guī)律的增長(zhǎng)，包括細(xì)菌體積的增大，代謝功能的完善及細(xì)菌數(shù)量的增多。不同的菌種有其各自不同生長(zhǎng)規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)顯示白色念珠菌生長(zhǎng)的遲緩期為0-16h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為16-30 h，之后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰退期，因此在對(duì)白色念珠菌進(jìn)行研究時(shí)，我們一般選取培養(yǎng)24-28 h的培養(yǎng)物進(jìn)行研究。
白色念珠菌在女性陰道中的發(fā)病率較高，隨著抗生素、免疫抑制劑及各種激素的廣泛使用，各種細(xì)菌的耐藥性逐年升高，而真菌的藥敏情況亦如此。為了給臨床提供治療白色念珠菌的有效途徑，我們對(duì)2008年我院分離的198株白色念珠菌進(jìn)行藥敏分析，結(jié)果顯示:氟胞嘧啶、兩性霉素、制霉素的敏感率較高，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道大多耐藥性一致，而敏感性有差異，這可能跟不同地區(qū)的用藥習(xí)慣有關(guān)。酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑作為廣譜抗真菌藥，應(yīng)用廣泛，導(dǎo)致中度敏感和耐藥性增高。因此，臨床在治療白色念珠菌時(shí)，特別反復(fù)感染白色念珠菌者，應(yīng)做藥敏試驗(yàn)，避免藥物濫用，以達(dá)到最佳的治療效果。
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