傳統腌干魚制品中降解生物胺菌株的篩選、生長曲線及影響因素（一）
為獲得用于咸魚等腌制水產品的生物胺降解菌，本文采用生物胺初篩培養基與高效液相色譜技術分析，研究從傳統方法加工的咸魚中分離篩選具有降解生物胺的菌株，通過VITEK 2鑒定系統進行菌種鑒定，并分析菌株的生長曲線、降解生物胺動力學、溫度、pH、鹽度、生物胺底物濃度等特性，及在咸魚中接種菌株對產品生物胺的影響。結果表明:從咸魚中分離篩選到三株具有降解生物胺的菌株，分別是鼠李糖乳酸菌(Lactobacillusrhamnosus，Lr)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，Lp)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，Pp);對生物胺降解的最適溫度為30～35℃，最適pH為5.5～6.0，對食鹽有較好的耐受性，在食鹽濃度≤80 g/L時對生物胺的降解作用尤為明顯，Lr與Lp之間無拮抗作用;接種了生物胺降解菌的咸魚產品中腐胺、尸胺、組胺、酪胺等生物胺含量均顯著性降低(p<0.05)，而接種Lr∶Lp=1∶2的混合菌種的咸魚產品生物胺含量下降幅度最大。
腌制咸魚是一種風味獨特的傳統水產品，深受廣大消費者的喜愛。其傳統生產工藝屬自然發酵，發酵過程微生物種類復雜，產品的品質和安全性難以得到保證。生物胺普遍存在于蛋白質含量豐富的發酵食品中，如發酵香腸、干酪、咸魚、魚露等。當其在人體內積累到較高數量時就會出現一些諸如頭痛、惡心、痙攣等一系列中毒性狀，嚴重的甚至會危及生命。生物胺含量是微生物分泌的氨基酸脫羧酶和生物胺氧化酶共同作用的結果，即脫羧酶催化氨基酸脫羧基，產生并積累生物胺，生物胺氧化酶則氧化并降解生物胺。
長期以來，研究人員一直在嘗試開發能有效控制生物胺的方法，大部分都是通過抑制食品中生物胺產生菌的數量或氨基酸脫羧酶的活性來減少生物胺的產生，如輻照、低溫貯藏、真空包裝等，這些方法在一定程度上可以減少生物胺的產生，但不能消除已產生的生物胺。近年來，具有胺氧化酶的微生物成為研究熱點，通過接種無氨基酸脫羧酶或含生物胺氧化酶的微生物制劑，使其在發酵過程中成為優勢菌，從而降解生物胺或抑制生物胺的生成。目前國內外對乳酸菌降解生物胺開展了相關研究。馬宇霞等從熏馬腸中分離鑒定了6株生物胺氧化酶菌株，其中包括鼠李糖乳酸菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌三株乳酸菌;Tosukhowong等研究了植物乳桿菌BCC 9546作為一種降解菌對發酵香腸中生物胺的降解作用;Nie等報道了銀魚香腸接種植物乳桿菌后會對其生物胺產生影響。
目前有關乳酸菌的降解特性還未見文獻報道，因此，本實驗室從傳統腌干魚制品中分離篩選具有生物胺降解活性的微生物，為腌干魚加工過程中發酵劑的選擇提供菌種來源，提高其可食用安全性，并探討溫度、pH、食鹽濃度和生物胺底物濃度對生物胺降解的影響，為生物胺的控制研究提供理論依據，并為腌干魚的工藝革新提供參考。
1材料與方法
1.1材料與儀器
咸魚傳統法腌制，實驗室自制;生物胺標準品:腐胺(PUT)(≥98%)、尸胺(CAD)(≥95%)、組胺(HIS)(≥99%)、酪胺(TYR)(≥99%)均購自美國Sigma公司;乙腈(色譜純)、丹磺酰氯(Dns-Cl，≥99%)、甲醇(色譜純)均購自上海安譜科學儀器有限公司;丙酮(色譜純)購自美國Burdick&Jackson公司;MRS培養基、MRS肉湯培養基均購自廣東環凱微生物科技有限公司;其它化學試劑均為分析純，購于廣州粵升試劑公司;實驗用水均為超純水。
Agilent 1100高效液相色譜儀美國Agilent公司;立式蒸汽壓力滅菌鍋388型上海申安醫療器械廠;3K30冷凍離心機美國Sigma公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺江蘇蘇凈安泰公司;SPX-320生化培養箱寧波東南儀器廠;TU-1990紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;T25高速均質機德國IKA公司;熱泵除濕干燥箱上海一恒科技有限公司;VITEK 2 Compact菌種鑒定系統法國生物梅里埃公司。
1.2實驗方法
1.2.1降解生物胺菌的篩選及鑒定在無菌條件下取咸魚背部肌肉10 g，剪碎后放入裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，混合均勻，用無菌生理鹽水依次稀釋為102、103、104倍，取1 mL上述不同濃度的稀釋液涂布于MRS培養基中，然后置于30℃的恒溫培養箱中培養48 h，挑單菌落以平板劃線的方法多次純化。將純化后的單菌落分別接入到改良型MRS肉湯培養基中，以不接種菌的培養基作對照，30℃培養48 h后取樣，測定培養基中的生物胺含量。將具有生物胺降解活性的乳酸菌接種于3 mL無菌鹽水(4.5 g/L NaCl，pH4.5～7.0)中，混勻，用比濁儀配制相當于0.80～0.10麥氏單位的菌懸液，使用VITEK 2全自動微生物分析系統進行菌種鑒定。
1.2.2生物胺降解菌的生長曲線測定
將乳酸菌活化后，以2%的接種量接入MRS肉湯培養基中，于30℃條件下培養，在48 h內每隔6 h取一定量的菌液，稀釋到適宜倍數，測定OD600值。
1.2.3菌株對混合生物胺的降解動力學研究
將菌活化后，以2%的接種量分別接種于50 mL，pH為5.5的含四種生物胺(腐胺、尸胺、組胺和酪胺，濃度分別為100 mg/L)的MRS肉湯培養基中，分別置于30℃條件下恒溫培養48 h，以未接種的培養基作空白對照，在48 h內每隔6 h取樣檢測實驗組和對照組培養基中生物胺含量，根據公式1計算各生物胺的降解率，繪制菌株對混合生物胺的降解動力學曲線。
式(1)
式中:W0-對照組中生物胺的含量，mg/L;W1-實驗組中生物胺的含量，mg/L。