模擬失重條件下大腸埃希菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、差異基因及富集分析結(jié)果（二）
隨著我國(guó)航天事業(yè)的飛速發(fā)展，航天員在空間站工作的時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)，在航天多種特殊環(huán)境中，失重一直是研究者們最為重視的一種環(huán)境。有研究表明，在航天失重環(huán)境中，人體的免疫力會(huì)有所下降，使航天員的身體對(duì)抗各種致病微生物的能力下降。同時(shí)，長(zhǎng)期寄居于人體的正常菌群及條件致病菌在航天特殊環(huán)境中也同樣會(huì)受到失重環(huán)境的影響。在航天飛行期間，這些細(xì)菌可以在失重條件下發(fā)生毒力、耐藥性變化等，導(dǎo)致其致病性增強(qiáng)，從而使航天員患感染性疾病的可能性增加，也可對(duì)航天環(huán)境中的空氣、水、食品安全性造成威脅。
大腸埃希菌是寄居于人體腸道內(nèi)最常見(jiàn)的條件致病菌，在一定條件下可以引起胃腸道、泌尿道等多種局部組織器官感染，對(duì)人體健康具有潛在的威脅。既往研究表明，在模擬航天失重環(huán)境下，大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯菌等的基因表達(dá)可發(fā)生相應(yīng)的變化，如在模擬失重條件下培養(yǎng)大腸埃希菌K12后，統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)了16個(gè)上調(diào)基因和19個(gè)下調(diào)基因；與正常重力組相比，在模擬失重環(huán)境下培養(yǎng)肺炎克雷伯菌14 d，共有171個(gè)基因表達(dá)失調(diào)，包括負(fù)責(zé)3型纖維體及其調(diào)節(jié)因子的基因，可導(dǎo)致其生物膜形成能力增強(qiáng)；一項(xiàng)研究證實(shí)，模擬失重誘導(dǎo)了鼠傷寒沙門(mén)氏菌163個(gè)基因差異表達(dá)，包括10個(gè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)毒力基因(表達(dá)下調(diào))，以及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑、毒力因子、脂多糖生物合成酶、鐵酶利用和功能未知蛋白質(zhì)的表達(dá)差異。寄生于人體內(nèi)的大腸埃希菌長(zhǎng)時(shí)間受到模擬失重環(huán)境的影響，會(huì)引起其基因表達(dá)變化，從而導(dǎo)致生物學(xué)性狀和毒力改變，繼而影響航天員健康和航天器環(huán)境生物安全。因此，研究模擬失重環(huán)境下大腸埃希菌基因表達(dá)的變化及其與生物學(xué)性狀變化間的聯(lián)系，可為航天員的身體健康提供保障，為未來(lái)的航天生物安全防護(hù)打好基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種大腸埃希菌(CICC 10389)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
1.1.2試劑胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、RNA保存液、Total RNA Extractor購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Qubit 2.0 RNA檢測(cè)試劑盒、Qubit RNA檢測(cè)試劑盒、Qubit DNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；Ribo-off rRNA Depletion kit(bacteria)、VAHTSTMStranded mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina®、VAHTSTMDNA Clean Beads購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。
1.1.3儀器Gravite重力控制系統(tǒng)；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫振蕩器；恒溫振蕩培養(yǎng)箱；生物安全柜；生物安全型離心機(jī)；Qubit 2.0熒光計(jì)、Qubit熒光計(jì)；微型漩渦混合儀；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)；電泳儀；生物電泳圖像分析；微量分光光度計(jì)；PCR儀。
1.2方法
1.2.1培養(yǎng)基配置
溶菌肉湯(Luria-Bertani，LB)液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，溶解在1 L雙蒸水中，121℃高壓滅菌30 min后，于4℃保存。
LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，溶解在1 L雙蒸水中，121℃高壓滅菌30 min后，將液體倒入細(xì)菌培養(yǎng)皿中，凝固后放至4℃保存。
1.2.2大腸埃希菌培養(yǎng)
為明確模擬失重條件對(duì)大腸埃希菌基因的影響，把大腸埃希菌分為兩組(正常重力組和模擬失重組)進(jìn)行比較。先將保存的單克隆甘油菌種接種到LB固體培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)12 h后，挑取單克隆菌落接種在裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的搖菌管中，37℃、200 r/min，過(guò)夜活化。將活化的菌液按體積比1∶500接種于裝滿新鮮LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中(體積約73 mL)，排空氣泡。模擬失重組將接種好細(xì)菌的培養(yǎng)瓶放置在Gravite重力控制系統(tǒng)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，2 r/min，37℃；正常重力組將接種好細(xì)菌的培養(yǎng)瓶放置在恒溫振蕩器中，水平振蕩培養(yǎng)，2 r/min，37℃。每24 h按體積比1∶500接種于裝滿新鮮LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代，連續(xù)培養(yǎng)14 d。
1.2.3 RNA提取及質(zhì)檢
運(yùn)用Total RNA Extractor試劑盒，將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5～10 min，使得核蛋白與核酸完全分離。加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。12 000 r/min 4℃離心10 min。吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min。12 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清。加入1 mL乙醇(750 mL/L)洗滌沉淀。12 000 r/min 4℃離心3 min，棄上清。室溫干燥5～10 min。加入30～50μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。將所得到的RNA溶液置于-70℃保存或立刻用于后續(xù)試驗(yàn)。用Qubit 2.0檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA完整性以及基因組污染情況。質(zhì)檢結(jié)果顯示樣本質(zhì)量均基本滿足建庫(kù)測(cè)序質(zhì)量要求。
1.2.4原核RNA轉(zhuǎn)錄
組建庫(kù)該部分委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。具體步驟參照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)。
1.2.5基因表達(dá)差異分析采用TMM對(duì)read count數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，之后運(yùn)用DEGseq進(jìn)行差異分析，為了得到顯著差異的基因，我們將篩選條件設(shè)為：P≤0.05且|log2(Fold Change)|≥1。
1.2.6關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析借助GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，使用clusterProfiler進(jìn)行功能富集分析，P<0.05表示該功能存在顯著富集情況。
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