奧西替尼耐藥肺癌腦轉移顱內(nèi)的原位PDX模型構建方法
奧希替尼是一種不可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，被批準用于EGFR敏感突變的非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者的一線治療，及治療后出現(xiàn)T790M突變患者的二線治療。盡管有效，但隨著治療的推進，患者對奧希替尼出現(xiàn)耐藥性不可避免，需要保持患者特征的細胞和小鼠模型來研究奧西替尼的耐藥機制。
傳統(tǒng)的細胞系以及其注射小鼠構建的動物模型，因為其細胞經(jīng)過反復傳代，丟失了患者的部分基因信息和表征。不能反映患者腫瘤的異質性、細胞之間的相互作用和精準判斷治療反應。患者來源腦腫瘤異體種植模型(Patient-derived xenograft,PDX)，是保存患者信息最全面、最能重復患者腦腫瘤生物學行為的模型，比傳統(tǒng)細胞系好，能夠準確模擬腫瘤異質性。另外一方面，從PDX轉化來的患者來源腫瘤(PDXC)也保留了原始腫瘤的基因組和轉錄組特征，可以用于快速的細胞實驗。
目前，學術界及商界常用于腦轉移瘤研究的是人源的非小細胞肺癌細胞株A549，PC9，小鼠肺癌細胞株(Lewis lung carcinoma cells，LLC)，這些傳統(tǒng)的細胞株構建的模型包括細胞和小鼠腦轉移瘤模型，均不同程度的丟失了部分患者的遺傳信息及表征，因此，需要構建患者來源肺癌腦轉移原位PDX小鼠模型及PDXC細胞模型。
一種奧西替尼耐藥肺癌腦轉移顱內(nèi)的原位PDX模型構建方法，包括：
步驟A：獲取奧希替尼耐藥患者的腫瘤標本，對腫瘤標本進行剔除掉電凝燒灼部分的腫瘤細胞，留取活性部分腫瘤；
步驟B：將腫瘤細胞保存在無血清的DMEM離心管中；
步驟C：取出腫瘤細胞，在培養(yǎng)皿中切成小片，加入第一培養(yǎng)液培養(yǎng)后進行吹打，并離心后獲得單個細胞；
步驟D：立體定向儀固定，注射預設數(shù)量的腫瘤細胞至裸鼠的腦內(nèi)；
步驟E：當小鼠出現(xiàn)體重明顯下降，食欲差、或者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀時，收取部分裸鼠大腦；步驟F：冠狀位切取有腫瘤的小鼠大腦，進行H＆amp;E切片染色及CK7、TTF-1免疫組化染色，與患者的H＆amp;E及免疫組化染色進行對比；
步驟G：在步驟F執(zhí)行的同時，將剩余小鼠基于無菌顯微鑷分離顱內(nèi)轉移瘤，完整將小鼠PDX腫瘤取出并保存至無菌培養(yǎng)皿，無菌刀片將腫瘤切除預設尺寸的小塊，無菌離心管收集預設尺寸的腫瘤小塊，加入第一預設容量的第一培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)預設時長；加入第二預設容量的第二培養(yǎng)液，離心去上清，再加入第三預設容量的第二培養(yǎng)液，吹打細胞團，再加入第二預設容量的第二培養(yǎng)液，過濾器過濾，收集細胞懸液并計數(shù)，每個培養(yǎng)瓶一百萬個細胞/10ml第二培養(yǎng)液接種，得到原位PDXC模型，并將部分細胞懸液繼續(xù)接種至裸鼠顱內(nèi)進行傳代，完成耐藥肺癌腦轉移顱內(nèi)原位PDX模型；
步驟H：在步驟G執(zhí)行的同時，取部分細胞懸液中的細胞基于預設細胞數(shù)量接種于六孔板中的各個孔內(nèi)，放入芬蘭Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀（BIOSCREEN C°PRO全自動生長曲線分析儀能夠高通量篩選目的菌株，并能在短時間內(nèi)迅速完成培養(yǎng)條件的優(yōu)化，因為BIOSCREEN C°PRO能夠全自動日夜工作、培養(yǎng)、振蕩、測量同步進行。），實時監(jiān)控拍照，繪制生長曲線；
步驟I：將PDXC傳代3代后，取部分細胞進行奧希替尼藥物敏感性檢測，對照組為HCC4006細胞株。
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