奧西替尼耐藥肺癌腦轉(zhuǎn)移顱內(nèi)的原位PDX模型構(gòu)建方法
奧希替尼是一種不可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，被批準(zhǔn)用于EGFR敏感突變的非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者的一線治療，及治療后出現(xiàn)T790M突變患者的二線治療。盡管有效，但隨著治療的推進(jìn)，患者對(duì)奧希替尼出現(xiàn)耐藥性不可避免，需要保持患者特征的細(xì)胞和小鼠模型來研究奧西替尼的耐藥機(jī)制。
傳統(tǒng)的細(xì)胞系以及其注射小鼠構(gòu)建的動(dòng)物模型，因?yàn)槠浼?xì)胞經(jīng)過反復(fù)傳代，丟失了患者的部分基因信息和表征。不能反映患者腫瘤的異質(zhì)性、細(xì)胞之間的相互作用和精準(zhǔn)判斷治療反應(yīng)。患者來源腦腫瘤異體種植模型(Patient-derived xenograft,PDX)，是保存患者信息最全面、最能重復(fù)患者腦腫瘤生物學(xué)行為的模型，比傳統(tǒng)細(xì)胞系好，能夠準(zhǔn)確模擬腫瘤異質(zhì)性。另外一方面，從PDX轉(zhuǎn)化來的患者來源腫瘤(PDXC)也保留了原始腫瘤的基因組和轉(zhuǎn)錄組特征，可以用于快速的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
目前，學(xué)術(shù)界及商界常用于腦轉(zhuǎn)移瘤研究的是人源的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，PC9，小鼠肺癌細(xì)胞株(Lewis lung carcinoma cells，LLC)，這些傳統(tǒng)的細(xì)胞株構(gòu)建的模型包括細(xì)胞和小鼠腦轉(zhuǎn)移瘤模型，均不同程度的丟失了部分患者的遺傳信息及表征，因此，需要構(gòu)建患者來源肺癌腦轉(zhuǎn)移原位PDX小鼠模型及PDXC細(xì)胞模型。
一種奧西替尼耐藥肺癌腦轉(zhuǎn)移顱內(nèi)的原位PDX模型構(gòu)建方法，包括：
步驟A：獲取奧希替尼耐藥患者的腫瘤標(biāo)本，對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行剔除掉電凝燒灼部分的腫瘤細(xì)胞，留取活性部分腫瘤；
步驟B：將腫瘤細(xì)胞保存在無血清的DMEM離心管中；
步驟C：取出腫瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中切成小片，加入第一培養(yǎng)液培養(yǎng)后進(jìn)行吹打，并離心后獲得單個(gè)細(xì)胞；
步驟D：立體定向儀固定，注射預(yù)設(shè)數(shù)量的腫瘤細(xì)胞至裸鼠的腦內(nèi)；
步驟E：當(dāng)小鼠出現(xiàn)體重明顯下降，食欲差、或者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀時(shí)，收取部分裸鼠大腦；步驟F：冠狀位切取有腫瘤的小鼠大腦，進(jìn)行H＆amp;E切片染色及CK7、TTF-1免疫組化染色，與患者的H＆amp;E及免疫組化染色進(jìn)行對(duì)比；
步驟G：在步驟F執(zhí)行的同時(shí)，將剩余小鼠基于無菌顯微鑷分離顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤，完整將小鼠PDX腫瘤取出并保存至無菌培養(yǎng)皿，無菌刀片將腫瘤切除預(yù)設(shè)尺寸的小塊，無菌離心管收集預(yù)設(shè)尺寸的腫瘤小塊，加入第一預(yù)設(shè)容量的第一培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)預(yù)設(shè)時(shí)長；加入第二預(yù)設(shè)容量的第二培養(yǎng)液，離心去上清，再加入第三預(yù)設(shè)容量的第二培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞團(tuán)，再加入第二預(yù)設(shè)容量的第二培養(yǎng)液，過濾器過濾，收集細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，每個(gè)培養(yǎng)瓶一百萬個(gè)細(xì)胞/10ml第二培養(yǎng)液接種，得到原位PDXC模型，并將部分細(xì)胞懸液繼續(xù)接種至裸鼠顱內(nèi)進(jìn)行傳代，完成耐藥肺癌腦轉(zhuǎn)移顱內(nèi)原位PDX模型；
步驟H：在步驟G執(zhí)行的同時(shí)，取部分細(xì)胞懸液中的細(xì)胞基于預(yù)設(shè)細(xì)胞數(shù)量接種于六孔板中的各個(gè)孔內(nèi)，放入芬蘭Bioscreen全自動(dòng)微生物生長曲線分析儀（BIOSCREEN C°PRO全自動(dòng)生長曲線分析儀能夠高通量篩選目的菌株，并能在短時(shí)間內(nèi)迅速完成培養(yǎng)條件的優(yōu)化，因?yàn)锽IOSCREEN C°PRO能夠全自動(dòng)日夜工作、培養(yǎng)、振蕩、測(cè)量同步進(jìn)行。），實(shí)時(shí)監(jiān)控拍照，繪制生長曲線；
步驟I：將PDXC傳代3代后，取部分細(xì)胞進(jìn)行奧希替尼藥物敏感性檢測(cè)，對(duì)照組為HCC4006細(xì)胞株。
相關(guān)新聞推薦
1、不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)耐鋅菌株的生長特性的影響（一）
2、沼澤紅假單胞菌R1菌株的培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件、生長量及影響因素（一）
3、肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對(duì)橙汁品質(zhì)影響——討論與結(jié)論