大腸桿菌噬菌體Bp4抗性菌株與其敏感菌株培養(yǎng)特性及耐藥性檢測(cè)（二）
2.3敏感菌株與抗性菌株基因組差異的分析
將敏感菌株與抗性菌株分別測(cè)序。結(jié)果顯示，O78型敏感菌株與O78-R抗性菌株基因組全長均為4 798 435 bp。兩組測(cè)序數(shù)據(jù)的比對(duì)分析結(jié)果顯示，抗性菌株中有3個(gè)堿基發(fā)生突變，分別位于3個(gè)重疊群（contig）中（表1）。
表1顯示，3個(gè)堿基的突變涉及到3個(gè)氨基酸，分別為乙醛脫氫酶的N→Y，十一碳二烯磷酸α-N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶1的W發(fā)生無義突變，以及UpfB蛋白L發(fā)生同義突變。致噬菌體發(fā)生抗性的原因很可能為contig00024中65 018 nt處的堿基突變，密碼子由TGG變?yōu)門AG，編碼的氨基酸由色氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，從而致蛋白質(zhì)翻譯提前終止，致使抗性菌株的葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶由敏感菌株的372個(gè)氨基酸縮短為133個(gè)氨基酸，不能執(zhí)行正常的酶功能（圖3）。
表1抗性菌株突變點(diǎn)的信息
圖3敏感菌株O78與抗性菌株O78-R氨基酸序列比對(duì)
2.4敏感菌株與抗性菌株的血清型鑒定
采用玻板凝集法對(duì)O78型敏感菌株及O78-R抗性菌株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示，O78型敏感菌株與O78抗血清呈明顯的凝集現(xiàn)象，液滴邊緣出現(xiàn)麩皮樣顆粒狀的凝集片，液體清亮；O78-R抗性菌株與O78抗血清的凝集現(xiàn)象不明顯，液體渾濁，且有少量細(xì)微顆粒。表明敏感菌株確為O78血清型，而抗性菌株血清型發(fā)生了改變，已不能鑒定為O78血清型。
2.5敏感菌株與抗性菌株的藥敏試驗(yàn)
采用藥敏紙片法分別檢測(cè)O78型敏感菌株與O78-R抗性菌株的藥物敏感性。結(jié)果顯示，與敏感菌株相比，O78-R抗性菌株對(duì)替米考星、環(huán)丙沙星、氨曲南、妥布霉素的抑菌圈直徑增大，耐藥性降低（表2），表明噬菌體抗性菌株比其敏感菌株對(duì)以上抗生素更敏感。
表2藥敏試驗(yàn)結(jié)果
2.6敏感菌株與抗性菌株對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果
將敏感菌株與抗性菌株的增殖液經(jīng)腹腔接種小鼠，記錄小鼠的體況計(jì)分及存活率。結(jié)果顯示，抗性菌株接種的小鼠未出現(xiàn)死亡，在感染后0～48 h小鼠體況計(jì)分一直維持在45分以上，之后略有下降（圖4A）；而敏感菌株接種的小鼠在接種后72 h內(nèi)共死亡4只，體況計(jì)分比抗性菌株接種的小鼠約低30分（圖4B），表明噬菌體抗性菌株對(duì)小鼠的致病性降低。
圖4兩組小鼠的體況計(jì)分（A）及存活率（B）統(tǒng)計(jì)結(jié)果
3討論
為了研究噬菌體的抗性突變大腸桿菌菌株與其敏感菌株的差異，本研究經(jīng)雙層平板法篩選出對(duì)噬菌體具有抗性的大腸桿菌突變菌株，雖然在形態(tài)及培養(yǎng)特性上該抗性菌株與其敏感菌株未表現(xiàn)出差異，但該抗性菌株不再與O78抗血清發(fā)生強(qiáng)陽性的凝集反應(yīng)，不再屬于O78血清型。
基因組測(cè)序及分析結(jié)果顯示，敏感菌株與抗性菌株基因組的全長一致，證明抗性菌株并無基因缺失和插入，但在抗性菌株中出現(xiàn)3處堿基的突變，導(dǎo)致1個(gè)同義突變，1個(gè)氨基酸替換（乙醛脫氫酶）以及1個(gè)無義突變。乙醛脫氫酶負(fù)責(zé)催化乙醛氧化為乙酸的反應(yīng)，參與細(xì)菌的代謝，與噬菌體的感染無關(guān)。無義突變導(dǎo)致抗性菌株的十一碳二烯磷酸α-N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶1的翻譯提前終止，而該蛋白參與細(xì)菌外膜中脂多糖O抗原的生物合成途徑[10]，導(dǎo)致脂多糖O抗原的合成受到抑制，提示該蛋白的突變是導(dǎo)致噬菌體不能感染抗性菌株的原因。本研究所用的噬菌體Bp4屬于短尾噬菌體科，為N4類噬菌體[11]，短尾噬菌體中N4類噬菌體G7C識(shí)別大腸桿菌表面的脂多糖受體[12]，T7類噬菌體尾部蛋白識(shí)別的也是宿主菌表面的脂多糖受體[13]，推測(cè)脂多糖也是噬菌體Bp4的受體。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁外膜中鑲嵌大量的脂多糖[14]。革蘭氏陰性菌的脂多糖由3部分組成：從內(nèi)向外依次為脂質(zhì)A、核心多糖、多糖側(cè)鏈，多糖側(cè)鏈又稱為O-抗原，當(dāng)脂多糖中的任何一部分缺失均會(huì)對(duì)脂多糖的合成造成影響。本實(shí)驗(yàn)中篩選的抗性菌株是由于堿基突變導(dǎo)致了色氨酸變?yōu)榻K止密碼子，致脂多糖中參與O抗原生物合成的N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶的翻譯提前終止。通過凝集試驗(yàn)鑒定敏感菌株與抗性菌株的O抗原，結(jié)果顯示敏感菌株為典型的O78血清型，而抗性菌株不再與O78抗血清發(fā)生凝集，不能鑒定為O78血清型。該結(jié)果證實(shí)O抗原是噬菌體Bp4識(shí)別并吸附宿主菌的關(guān)鍵受體。大腸桿菌的O抗原類型與其致病性有直接相關(guān)性，每株大腸桿菌只含有一種O抗原，能致雞大腸桿菌病的常見血清型為O1、O2、O35及O78[15]。本研究獲得的噬菌體抗性菌不再具有O78抗血清的凝集性，提示細(xì)菌的致病性可能下降。樂率等通過對(duì)銅綠假單胞菌PA1株與噬菌體的相互作用，篩選出抗性菌株P(guān)A1r并做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)抗性菌株可以分泌紅色素，且致病性下降[6]。噬菌體抗性菌株致病性的下降已被多項(xiàng)研究所證實(shí)[4,16]，本研究經(jīng)腹腔注射敏感菌株小鼠的死亡率達(dá)到40%，而腹腔注射抗性菌株小鼠的死亡率為0，也證明了噬菌體抗性菌株致病性的下降。噬菌體抗性菌株致病性的下降會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)更容易被免疫系統(tǒng)清除。
本研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體抗性菌株的耐藥性發(fā)生了改變，其對(duì)替米考星、環(huán)丙沙星、氨曲南、妥布霉素的抑菌圈直徑增大，比噬菌體敏感菌株的耐藥性降低，該結(jié)果與Jalasvuori報(bào)道的結(jié)果類似[17]。噬菌體抗性菌株耐藥性的下降會(huì)導(dǎo)致其在較低的抗生素濃度下即可被殺死。
噬菌體抗性菌株產(chǎn)生的幾率大約為千萬分之一。細(xì)菌對(duì)噬菌體的抗性是相對(duì)的，其對(duì)一株噬菌體產(chǎn)生抗性，但還可以被其他的噬菌體感染。于玲等分離到對(duì)大腸桿菌具有抗性的噬菌體，并將其與原噬菌體混合制成新的噬菌體雞尾酒用于殺菌，結(jié)果表明，該噬菌體雞尾酒不僅具有明顯的殺菌效果，而且在體外降低了噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生和突變頻率[18]。
噬菌體抗性突變菌株的產(chǎn)生是細(xì)菌和噬菌體相互作用的結(jié)果，抗性菌株的產(chǎn)生必然會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌基因組及表型的變化。本研究通過分析大腸桿菌短尾噬菌體Bp4的抗性菌株和敏感菌株，發(fā)現(xiàn)抗性菌株的耐藥性和致病性均下降，說明噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生不會(huì)對(duì)噬菌體治療效果產(chǎn)生較多副作用，也為噬菌體治療中出現(xiàn)抗性菌問題的解決提供了參考依據(jù)。
大腸桿菌噬菌體Bp4抗性菌株與其敏感菌株培養(yǎng)特性及耐藥性檢測(cè)（一）
大腸桿菌噬菌體Bp4抗性菌株與其敏感菌株培養(yǎng)特性及耐藥性檢測(cè)（二）
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