基于ELISA和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線應(yīng)用的結(jié)合定量檢測(cè)腸炎沙門氏菌（一）
沙門氏菌屬(salmonella)是一大群寄生于人類和動(dòng)物腸道內(nèi)，生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭氏陰性桿菌［1，2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。國(guó)內(nèi)外對(duì)食品中沙門氏菌的檢測(cè)技術(shù)或檢測(cè)方法研究并不鮮見［3-5］。這些方法大都都是對(duì)沙門氏菌的定性檢測(cè)但是對(duì)沙門氏菌定量研究很少。目前，僅有SN/T0040-1992是沙門氏菌定量方法，原理是基于MPN法實(shí)現(xiàn)定量。SN/T0040-1992雖然可以定量檢測(cè)但是缺點(diǎn)操作繁瑣，需要稀釋三個(gè)梯度或更多，每個(gè)梯度3管共9管，每個(gè)管都要進(jìn)行陰陽性判斷才能確定，耗時(shí)費(fèi)力，同時(shí)，該方法由于從225 ml 10倍樣品稀釋液中取1 ml用來增菌培養(yǎng)存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)。本課題以腸炎沙門氏菌為例對(duì)沙門氏菌定量研究模型進(jìn)行探討，基于ELISA和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線應(yīng)用的結(jié)合，研究沙門氏菌的定量，開發(fā)一種一種操作簡(jiǎn)單有效能夠?qū)悠分猩抽T氏菌本底含量檢測(cè)的方法。
1材料與方法
1.1材料與儀器
1.1.1實(shí)驗(yàn)儀器:MiniVidas酶聯(lián)免疫分析儀制造商生物梅里埃，恒溫培養(yǎng)箱型號(hào)INE600制造商MEMMERT。
1.1.2培養(yǎng)基:緩沖蛋白胨水(BP)海博生物批號(hào)20120509，亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)海博生物批號(hào)20120506，四硫磺酸鹽煌綠增菌液(TTB)海博生物批號(hào)20120309，亞硫酸鉍瓊脂(BS)海博生物批號(hào)20120417，DHL瓊脂海博生物批號(hào)20120315，3M菌落總數(shù)測(cè)試片規(guī)格型號(hào)PertrifilimTM 6406批號(hào)2013-10TP。
1.1.3菌株:腸炎沙門氏菌株(salmonella enteritidis)3代，大腸桿菌(escherichia coli)3代(購置中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心)，奇異變形菌(P.mirabilis)2代(實(shí)驗(yàn)室分離獲得)
1.2方法
1.2.1標(biāo)準(zhǔn)菌株活化:以無菌操作將菌株濾紙片放入10 mm緩沖蛋白凍水試管中，36℃培養(yǎng)過夜;培養(yǎng)液劃線接種平板BS，DHL培養(yǎng)24～48 h;挑去單菌落接種到盛有20 ml BPW的試管中培養(yǎng)18 h備用。
1.2.2菌液的梯度稀釋及計(jì)數(shù):10倍梯度稀釋菌液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，分別將10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液1 ml接種測(cè)試片，每個(gè)梯度接種2片，放入培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。
1.2.3酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)試值(熒光值)與沙門氏菌濃度函數(shù)關(guān)系建立:腸炎沙門氏菌株純化后挑去單菌落接種于緩沖蛋白胨水中10～20 ml 36℃培養(yǎng)12～18 h，分別進(jìn)行10倍稀釋，5倍稀釋，4倍稀釋3倍稀釋和2倍稀釋。選取2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1 000倍稀釋液使用Vidas檢測(cè)，同時(shí)使用3M細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)測(cè)試片對(duì)培養(yǎng)液10-5，10-6，10-7進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后建立Vidas測(cè)試值與沙門氏菌濃度(取對(duì)數(shù)值)數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系式。
1.2.4沙門氏菌在兩種培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線繪制:使用不同濃度沙門氏菌分別接種TTB(1、10、50、150、380 cfu/ml)、SC(0.58、5.8、20、58、200、580 cfu/ml)增菌液100 ml于42℃和36℃培養(yǎng)間隔1或2 h取樣，使用測(cè)試片對(duì)沙門氏菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)至16～20 h。繪制不同接種濃度沙門氏菌在兩種培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線。
1.2.5生長(zhǎng)曲線對(duì)人為污染樣品的檢測(cè):選用樣品常溫和冷鮮豬和雞肉25 g進(jìn)行人為污染，放入25 ml增菌液均質(zhì)1 min，然后加入剩下的200 ml增菌液置于36℃和42℃培養(yǎng)，分析建立的方法對(duì)人為污染樣本檢出的的誤差。
1.2.6干擾試驗(yàn):選擇大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，變形桿菌作為干擾菌。設(shè)置兩組相同的樣品，第1組如同驗(yàn)證試驗(yàn)部分，只添加一定濃度的腸炎沙門氏菌到樣品中，第2組在第1組的基礎(chǔ)上添加干擾菌混合液包括大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，單增李斯特氏菌和變形桿菌，每種干擾菌的添加量均是目標(biāo)菌10倍以上。操作同驗(yàn)證試驗(yàn)部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas對(duì)增菌液檢測(cè)。每種干擾菌的添加量均是目標(biāo)菌10倍以上。操作同驗(yàn)證試驗(yàn)部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas對(duì)增菌液檢測(cè)。
基于ELISA和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線應(yīng)用的結(jié)合定量檢測(cè)腸炎沙門氏菌（一）
基于ELISA和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線應(yīng)用的結(jié)合定量檢測(cè)腸炎沙門氏菌（二）
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