HIF-1α納米抗體對黑素瘤細(xì)胞增殖與生長（結(jié)果與分析、結(jié)論）
2結(jié)果與分析
2.1 HIF-1α納米抗體的篩選及序列特征
通過對陽性克隆的序列進(jìn)行比對，篩選出6個(gè)VHH序列。經(jīng)過ELISA法對6個(gè)陽性克隆進(jìn)行抗原結(jié)合力檢測，選取1A12作為候選克隆（表1）。1A12的核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的VHH序列相似性達(dá)到78%，通過對1A12克隆的氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)該序列沒有形成跨膜區(qū)，為親水性蛋白。1A12的氨基酸序列由88個(gè)氨基酸構(gòu)成，含有完整的4個(gè)框架區(qū)（FR1～FR4）和3個(gè)高度可變抗原結(jié)合區(qū)即互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1～CDR3），其中CDR3是抗原特異性識(shí)別的區(qū)域，含有11個(gè)氨基酸。
表1 HIF-1α單克隆ELISA篩選結(jié)果
2.2納米抗體表達(dá)、純化與結(jié)合性檢測
以挑選出的VHH（1A12）序列質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出大小約為400 bp的VHH片段（圖1-A）。將VHH片段與PMD19-T連接后再連接到pET-28a表達(dá)載體上以構(gòu)建質(zhì)粒（圖1-B）。
圖2質(zhì)粒的構(gòu)建
構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)原核表達(dá)和純化后，用考馬斯亮藍(lán)染色以及Western Blot進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，考馬斯亮藍(lán)染色得到的條帶較單一；Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)大小約為16 ku的特異性條帶，說明該蛋白為表達(dá)所得的特異蛋白。
選取小鼠腦組織，免疫組織化學(xué)一抗試驗(yàn)組用HIF-1α納米抗體，用PBS作對照，可看出大腦組織中的免疫陽性信號，由此可見，HIF-1α納米抗體可以與抗原HIF-1α結(jié)合，用于HIF-1α的組織定位。
Western Blot試驗(yàn)中一抗用純化所得的HIF-1α納米抗體，選取小鼠腦組織提取蛋白，結(jié)果顯示，HIF-1α納米抗體作為一抗可以與抗原HIF-1α結(jié)合，檢測到特異性的免疫陽性條帶，分子質(zhì)量約為100、120、130 ku，說明腦組織中表達(dá)HIF-1α。由此可知，制備的HIF-1α納米抗體可用于Western Blot試驗(yàn)的一抗以檢測組織中HIF-1α抗原表達(dá)的相對定量。
2.3 HIF-1α納米抗體對黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
將HIF-1α納米抗體加入B16細(xì)胞培養(yǎng)基中，用CCK-8法檢測并觀察對B16細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，在HIF-1α納米抗體作用下，在3～9 h內(nèi)，加入HIF-1α納米抗體的B16細(xì)胞表現(xiàn)出了抑制效果（圖2-A）。將HIF-1α納米抗體加入B16細(xì)胞培養(yǎng)基中，用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測HIF-1α納米抗體對B16細(xì)胞遷移的影響。B16細(xì)胞在培養(yǎng)0、12、24、36 h檢測，在12 h時(shí)已出現(xiàn)抑制細(xì)胞遷移現(xiàn)象（圖2-B）。
圖4 HIF-1α納米抗體對B16細(xì)胞增殖、遷移及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
在CCK-8法檢測HIF-1α納米抗體抑制B16細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，提取HIF-1α納米抗體處理15 h后的B16細(xì)胞總蛋白，用Western Blot檢測VEGF、RAS、ERK、RAC和RAF蛋白的表達(dá)量，與對照組相比，HIF-1α納米抗體處理B16細(xì)胞后其蛋白量均呈下降趨勢（圖2-C、D）。
3結(jié)論與討論
HIF-1α亞基是堿性-環(huán)-螺旋（basic-helixloop-helix,Bhlh）–PAS（per/ARNT/Sim，PAS）)超家族成員之一[21]，HIF-1α位于多種致癌和抑癌途徑的交匯點(diǎn)，包括PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路，而這些信號通路是分子信號網(wǎng)絡(luò)的核心，控制著許多細(xì)胞的生長、增殖、分化和生存，而腫瘤組織常高表達(dá)HIF-1α[22-23]。通過多種方式抑制HIF-1α的表達(dá)有望成為治療黑色素瘤的方法。
本研究通過已建立的羊駝源黑素瘤噬菌體文庫，以HIF-1α多肽進(jìn)行4輪淘篩，篩選出1株陽性單克隆菌株，經(jīng)過原核表達(dá)載體構(gòu)建并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，鎳柱純化得到HIF-1α納米抗體。所得的納米抗體抗原特異性識(shí)別區(qū)域CDR3含有11個(gè)氨基酸殘基超過了傳統(tǒng)抗體CDR3的平均長度（7～9個(gè)氨基酸殘基），可增大與抗原的接觸面積，因此其與抗原具有較好的親和性。VEGF家族是一類血管調(diào)節(jié)因子[24]，新生血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制之一，血管參與加速腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等過程[25]。在黑素瘤細(xì)胞中，HIF-1α納米抗體穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)中，與HIF-1α結(jié)合后，抑制VEGF下游靶基因表達(dá)，并抑制Ras信號路徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)，同時(shí)使黑素瘤細(xì)胞中ERK和P-ERK表達(dá)下調(diào)，ERK是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，該酶被激活后，成為磷酸化的ERK（P-ERK）。p-ERK可以介導(dǎo)信號由胞漿向胞核傳遞，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、分裂等多種生理過程，其異常表達(dá)在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[26]。并且發(fā)現(xiàn)HIF-1α納米抗體在黑素瘤細(xì)胞中引起RAF1表達(dá)下調(diào)，通過PLC-γ-PKC-Raf-MEKMAPK信號通路使細(xì)胞增殖和遷移速度下降[27]。此外，在腫瘤組織中，由于新生血管管壁僅有1層內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏基底膜，內(nèi)皮細(xì)胞間常有裂隙，同時(shí)VEGF本身可提高血管通透性，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放膠原酶使腫瘤細(xì)胞與腫瘤組織分離脫落，為腫瘤的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件[28]。因此，HIF-1α納米抗體在黑素瘤組織中可能會(huì)通過抑制血管形成而成為抑制腫瘤生長和發(fā)展的新材料。
本研究獲得的HIF-1α納米抗體分子質(zhì)量約為16 ku，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，具有親水性。HIF-1α納米抗體在構(gòu)建原核表達(dá)載體時(shí)加入了His標(biāo)簽，將HIF-1α納米抗體作為Western Blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)中的一抗，與組織細(xì)胞中的HIF-1α特異性結(jié)合，使用HRP-His-tag抗體作為二抗，來檢測HIF-1α在組織中的含量及分布。將自備的HIF-1α納米抗體作用于B16細(xì)胞時(shí)，HIF-1α納米抗體與HIF-1α結(jié)合，直接影響下游靶基因VEGF，并引發(fā)該信號通路的下調(diào)，抑制B16細(xì)胞的增殖和遷移，揭示其可能在黑色素瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著較為重要的作用，可作為基因治療黑色素瘤的靶點(diǎn)。
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