全自動菌落計數儀操作方法及實驗步驟【應用實例】
菌落是細菌或霉菌在一定溫度、時間、濕度條件下，于營養物質中生長繁殖而形成的能夠被我們所識別的生長物，形成以母細胞為中心的一團肉眼可見的，有一定形態、構造等特征的子細胞集落。菌落總數是指在一定條件下（培養時間、適宜溫度、pH值等）每克/毫升被測樣品所生長出來的菌落的總體數量。在紡織品微生物的檢測過程中常常會存在菌落計數問題，若平皿上的菌落數較少時可肉眼直接觀察計數，但在高污染樣品的檢測或者抗菌性試驗過程中，平皿上的菌落數較多，幾十個甚至幾百個，這種情況下要完成大批量檢驗檢疫時肉眼觀察菌落數存在耗時嚴重、眼睛易疲勞。另外，僅留下一個統計數字，原始數據結果無法保存，缺乏后期的數據分析，不利于實現檢測的準確性及數據化管理。
本試驗選擇自主合作研發的全自動菌落計數儀，對平皿上的菌落進行計數，與人工肉眼計數結果進行比較，以驗證全自動菌落計數儀的準確性、精密度和重現性，從而確定該全自動菌落計數儀是否符合菌落計數要求，能否應用于紡織產品中微生物的檢測計數。
1、材料與方法
1.1試劑與材料
營養瓊脂培養基、沙氏瓊脂培養基、營養肉湯，購于北京陸橋技術股份有限公司。
普通一次性使用口罩（非滅菌型）、醫用口罩（滅菌型）的試驗樣品均來源于市售。
1.2儀器與設備
全自動菌落計數儀（丹麥BioSense公司）、生物安全柜（ESCO AC2-6SI）、生化培養箱（賽默飛RI-250）、霉菌培養箱（賽默飛RI-150）、立式壓力蒸汽滅菌器（雅馬拓SQ510C）。
1.3標準菌株
細菌：大腸桿菌ATCC 8099、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢桿菌ATCC 6633，購于廣東省微生物研究所。試驗前按照說明書對所涉及的標準菌株進行活化。
1.4試驗方法
1.4.1菌懸液的制備
采用二步預培養程序制備每種細菌的接種菌懸液。從第3代菌種的試管斜面中取一環在營養瓊脂培養基平皿上畫線，在（37±1）℃下培養（22±2）h，然后在三角瓶中添加20mL營養肉湯，用接種環從已培養的平皿中挑一個典型的菌落，接種到營養肉湯中，在（37±1）℃下130r/min振蕩培養（19±1）h，即制得接種菌懸液，采用麥氏比濁法調整活菌數的濃度，活菌數應達到1×102CFU/mL～5×102CFU/mL，經稀釋法測定活菌數的濃度。
1.4.2準確性試驗
試驗選用一次性平皿的傾注法進行驗證，以檢測細菌菌落總數和真菌菌落總數。隨機選取不同批次的普通一次性使用口罩（非滅菌型）至少3個包裝，從每個包裝中取樣剪碎、稱取（10±1）g樣品，加入200mL滅菌生理鹽水，充分混勻后得到一個生理鹽水樣液。自然沉降后取上清液做菌落計數，共接種10個平皿，每個平皿中加入1mL樣液，其中5個平皿倒入45℃左右的熔化的營養瓊脂培養基15 mL～20mL，混勻凝固后，置（35±2）℃培養48h；另外5個平皿倒入45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養基15 mL～20mL，混勻凝固后，置（25±2）℃培養5～7天，檢測結果分別用目測法和儀器法進行計數，分析兩種計數結果的方法是否存在顯著性差異。
1.4.3精密度試驗
隨機選取10個不同批次的醫用口罩（滅菌型），每個樣品稱取（0.4±0.05）g，折疊成邊長為18mm的正方形，接種0.2mL上述濃度的菌懸液（大腸桿菌:金黃色葡萄球菌:枯草芽孢桿菌=1:1:1）后，立即向瓶內加入20mL冰冷生理鹽水，振蕩器振蕩（5s、5次），洗脫試樣上的活菌，用10倍稀釋法稀釋洗脫液，測定試樣上的活菌數，不接種菌懸液的樣品做空白對照，每個樣品做7組平行試驗，采用儀器法進行計數，并計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.4.4重現性試驗
同一個平皿采用兩種計數結果的方法，不同人員分別進行計數，以相對標準偏差來評價兩種計數方法的重現性，并計算相對標準偏差。
1.4.5數據分析
結果準確性采用minitab軟件進行配對T檢測分析，儀器法的精密度試驗結果偏差應小于10%，重現性的相對標準偏差應小于10%。
3、結果與分析
3.1準確性試驗
采用一次性平皿傾注法對隨機選取的20個批次普通一次性使用口罩（非滅菌型）進行菌落總數測定，分別采用目測法和儀器法對測試結果進行計數，見表1。
表1兩種計數方法的準確性驗證
目測法與儀器法所得的細菌菌落總數結果RSD小于10%的符合率為90%，所得的真菌菌落總數結果RSD小于10%的符合率為85%，可知平板菌落數采用目測法和儀器法檢測的偏差不大。另外，當菌落數落在30CFU/皿以下時，儀器法的準確性欠佳，RSD大于10%，這可能是菌落與培養基的顏色較為接近，或者培養皿上有氣泡且顏色與菌落差異不大時造成的誤判，或者皿內存在的水霧甚至小水珠也會影響計數儀的識別效果。對兩種計數結果進行配對T檢測分析，可知在95%置信區間內，P值大于0.05，在統計學上無顯著性差異。
3.2精密度驗證
隨機選取10個不同批次的醫用口罩（滅菌型），添加適宜濃度的菌懸液，采用儀器法對測試結果進行計數，見表2。
表2菌落計數的精密度驗證
由表2可知，兩種計數方法的相對標準偏差均小于10%，其中儀器法的平均相對標準偏差為1.26%，目測法的平均相對標準偏差為1.81%，儀器法的精密度整體上高于目測法。另外，對于部分樣品，存在儀器法的計數結果稍大于目測法，這主要是由于部分平皿上特別小的菌落，肉眼因看不清而未計數，而全自動菌落計數儀可放大后再計數。
3.3重現性驗證
不同試驗人員分別采用兩種計數方法對同一個平皿進行計數，以相對標準偏差來評價兩種計數方法的重現性，見表3。由表3可知，不同人員采用兩種方法對菌落進行計數，其相對標準偏差均小于10%，符合重現性要求。
表3兩種計數方法的重現性驗證
通過不同試驗人員對全自動菌落計數儀（圖1）進行操作，可知儀器操作相對簡便，圖像采集過程中無需調節光度，系統能自動調整使其照出最佳效果；根據實際需求可選擇4個皿或6個皿一鍵計數，選擇適宜的待測組別即可進行讀數；計數過程中可人為增加或刪除菌落個數進行人工修正，有樣本稀釋度輸入、報告輸出等功能。
圖1全自動菌落計數儀的外觀圖
4、結論與討論
本研究主要探究了不同計數范圍的菌落計數，通過對目測法和儀器法的計數結果進行分析，在95%置信區間P值均大于0.05，在統計學上無顯著性差異，其精密度試驗和重現性試驗結果均在10%以內。全自動菌落計數儀在操作過程中，對大部分菌落能自動計數，極少部分需要人為識別進行增加、刪除或切割，或者當樣品對培養基背景具有干擾時，也需要人為識別，進而完善計數效果；整體上來說，對于正常的無背景干擾的菌落計數，儀器計數的準確度和精密度均較優，計數速度快，且儀器操作簡便、功能齊全實用，能直接保存計數結果和平皿圖片，利于后期查看。在日常紡織產品檢測中，全自動菌落計數儀的使用可有效減少試驗人員的工作負擔，確保試驗數據的可追溯性。今后，還需要不斷完善儀器功能，為試驗研究提供更高端、更高質量的服務。