微生物合成食品功能因子方法、研究策略和進(jìn)展（三）
4細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成解偶聯(lián)
產(chǎn)物的高效合成往往與底盤細(xì)胞生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)資源，在底物充足的條件下，對(duì)菌株生產(chǎn)力的最大限制來自用于支持細(xì)胞生長(zhǎng)和內(nèi)源性基礎(chǔ)代謝所需資源的持續(xù)消耗.當(dāng)導(dǎo)向目標(biāo)代謝途徑的資源不足時(shí)，大量的底物主要用于細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降.相反，過度的分流會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)從而降低生產(chǎn)強(qiáng)度.微生物底盤細(xì)胞的這種局限性可通過將細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成解偶聯(lián)來解決[104~106].將發(fā)酵過程解耦成生長(zhǎng)和生產(chǎn)兩個(gè)階段進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控，通過嚴(yán)格控制細(xì)胞的基礎(chǔ)生長(zhǎng)，在發(fā)酵早期最大程度地積累生物量，然后通過誘導(dǎo)激活合成途徑將資源轉(zhuǎn)向生產(chǎn)途徑，這樣細(xì)胞可在半衰老狀態(tài)下工作，吸收利用底物進(jìn)行產(chǎn)品合成。
4.1化合物誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)
特定化學(xué)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分可以作為用于解偶細(xì)胞生長(zhǎng)的誘導(dǎo)劑[107，108].IPTG和無水四環(huán)素是常用的誘導(dǎo)劑，已被用于1，4-丁二醇[109]、異丙醇[110]和蘋果酸[111]等的生物合成調(diào)控.營(yíng)養(yǎng)成分如甲硫氨酸被用于抑制PM ET3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)以解偶細(xì)胞生長(zhǎng)，提高青蒿素前體紫穗槐二烯的生物合成[112].Tan等人[113]在S.cerevisiae中利用四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)將碳通量轉(zhuǎn)向產(chǎn)物合成，使得葡萄糖酸和異丁醇產(chǎn)量分別提高10倍和3倍.外源性誘導(dǎo)劑的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)是有效的，但需要精確控制誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)強(qiáng)度。
4.2群體感應(yīng)系統(tǒng)
基于內(nèi)源性壓力感應(yīng)機(jī)制，開發(fā)可自發(fā)調(diào)節(jié)的遺傳回路以控制代謝是解偶細(xì)胞生長(zhǎng)的另一種策略.群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)是一種響應(yīng)細(xì)胞密度的基因回路，可以根據(jù)細(xì)胞密度自適應(yīng)地將碳通量從生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)途徑[114，115].目前研究最為廣泛的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要是來自費(fèi)氏弧菌的luxI/luxR系統(tǒng)[116]和來自玉米細(xì)菌性枯萎病菌的esaI/esaR系統(tǒng)[117].研究人員在E.coli中構(gòu)建基于luxI/luxR的群體感應(yīng)系統(tǒng)用于紅沒藥烯的生物合成，其生產(chǎn)能力比需要添加誘導(dǎo)劑的工程菌株提高44%[118].天然QS回路雖然可以響應(yīng)不同細(xì)胞密度進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控，但是其動(dòng)態(tài)調(diào)控的范圍較為狹隘.因此，Ge等人[119]通過優(yōu)化luxR-luxI基因間序列創(chuàng)建了一個(gè)具有高動(dòng)態(tài)調(diào)控范圍和低泄漏率的QS突變體庫，將其應(yīng)用于以E.coli作為底盤細(xì)胞合成4-羥基香豆素，其產(chǎn)量提高11.3倍.此外，該QS系統(tǒng)也廣泛用于改善E.coli合成柚皮素[120]和中鏈脂肪酸[121]等.Corrêa等人[122]在B.subtilis中構(gòu)建了基于luxI/luxR的群體感應(yīng)系統(tǒng)自誘導(dǎo)基因回路(圖3)，并用于核黃素的生產(chǎn).該系統(tǒng)包括兩大模塊，一個(gè)模塊是包含2種變體的誘導(dǎo)模塊——luxR和luxI基因以及各自的啟動(dòng)子，另一個(gè)模塊是包含7種變體的應(yīng)答模塊——產(chǎn)物合成相關(guān)基因和控制基因表達(dá)的群體感應(yīng)啟動(dòng)子.由LuxI合成的信號(hào)分子AHL擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，當(dāng)AHL濃度達(dá)到一定閾值后與LuxR結(jié)合，從而激活應(yīng)答模塊中靶基因的表達(dá).最終，最強(qiáng)響應(yīng)元件S1-R6的轉(zhuǎn)錄水平是B.subtilis內(nèi)源啟動(dòng)子Pv eg的3.2倍，篩選得到的工程菌株顯示出響應(yīng)細(xì)胞密度的核黃素生產(chǎn)曲線.然而，該群體感應(yīng)系統(tǒng)只能正向響應(yīng)信號(hào)分子的濃度，需要利用負(fù)調(diào)控元件才可進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，這會(huì)導(dǎo)致菌株代謝負(fù)擔(dān)加重和靈敏性降低等問題。
與luxI/luxR不同的是，esaI/esaR系統(tǒng)中的信號(hào)分子受體EsaR具有同時(shí)產(chǎn)生激活和抑制的雙重作用.在低細(xì)胞密度和信號(hào)分子AHL不存在時(shí)，EsaR可與啟動(dòng)子Pe saR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合抑制下游基因表達(dá)，也可與啟動(dòng)子Pe saS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合激活下游基因表達(dá);而在高細(xì)胞密度和AHL濃度積累到一定閾值后，AHL與EsaR作用使其無法再結(jié)合到轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，因此開啟Pe saR啟動(dòng)子下游基因的表達(dá)和抑制Pe saS啟動(dòng)子下游基因的表達(dá)[117].Gupta等人[123]通過微調(diào)EsaI的表達(dá)，利用該系統(tǒng)控制1-磷酸果糖激酶和莽草酸激酶的表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成途徑碳通量的平衡，并有效提高E.coli中肌醇、葡萄糖二酸和莽草酸的產(chǎn)量。
由于真核生物的轉(zhuǎn)錄抑制需要染色質(zhì)重塑，所以將這兩類群體感應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)用于S.cerevisiae仍具有挑戰(zhàn)性.因此，已經(jīng)設(shè)計(jì)了信息素群體感應(yīng)系統(tǒng)用于改善羥基苯甲酸(para-hydroxybenzoic acid，PHBA)[124，125]、2′-巖藻糖基乳糖和3′-巖藻糖基乳糖[126]的合成.此外，研究人員還在B.subtilis中構(gòu)建了基于Phr60-Rap60-Spo0A的雙功能群體感應(yīng)系統(tǒng)基因回路，通過解耦生長(zhǎng)和合成將維生素K2產(chǎn)量提高40倍[127].群體感應(yīng)系統(tǒng)的深入研究為動(dòng)態(tài)調(diào)控代謝途徑提供了新的指導(dǎo)，但仍有不足之處.基于群體感應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控存在泄露表達(dá)，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，仍需對(duì)基因元件進(jìn)行優(yōu)化或挖掘更多的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件等.其次，由于群體感應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，其調(diào)控機(jī)制尚未完成解析明了，實(shí)現(xiàn)完全的宿主解偶聯(lián)也仍需進(jìn)一步研究。
近年來，利用基于代謝物響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器來重編程細(xì)胞活性也已取得重大研究進(jìn)展[128].通過將傳感器——制動(dòng)器與底盤細(xì)胞集成，以動(dòng)態(tài)調(diào)控關(guān)鍵酶的表達(dá)并驅(qū)動(dòng)碳通量轉(zhuǎn)向目標(biāo)途徑.其中，丙二酰輔酶A是脂肪酸生物合成的前體，開發(fā)響應(yīng)丙二酰輔酶A的生物傳感器在克服限速途徑和優(yōu)化產(chǎn)量方面具有巨大的希望.FapR可以特異性響應(yīng)丙二酰輔酶A的濃度并調(diào)節(jié)B.subtilis脂肪酸生物合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)[129].Xu等人[130]設(shè)計(jì)響應(yīng)丙二酰輔酶A的雙啟動(dòng)子傳感器動(dòng)態(tài)調(diào)控胞內(nèi)丙二酰輔酶A的通量以優(yōu)化E.coli中脂肪酸的生物合成.在E.coli中，丙二酰輔酶A是通過accABCD基因編碼的乙酰輔酶A羧化酶催化乙酰輔酶A合成，而低水平的丙二酰輔酶A使FapR處于活性狀態(tài)，由p GAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的accABCD基因被激活，同時(shí)由T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的脂肪酸合成途徑被抑制，從而使丙二酰輔酶A得以在胞內(nèi)積累.隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，丙二酰輔酶A積累到一定濃度時(shí)，開-關(guān)狀態(tài)被轉(zhuǎn)換從而開啟脂肪酸的生物合成，使得細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成解偶聯(lián).后通過優(yōu)化FapR阻遏物結(jié)合位點(diǎn)fapO的數(shù)量，使得脂肪酸產(chǎn)量提高至3.86 g/L.另外也有研究通過設(shè)計(jì)分層遺傳回路[106]和代謝轉(zhuǎn)換開關(guān)[110]實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)與生產(chǎn)解偶聯(lián)，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成.細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成解偶聯(lián)可以通過嚴(yán)格控制非必需基因的基礎(chǔ)表達(dá)，使得代謝負(fù)擔(dān)最小化，從而在發(fā)酵早期階段最大限度積累生物量.一旦達(dá)到一定的細(xì)胞密度時(shí)，便可將資源轉(zhuǎn)移至產(chǎn)物合成途徑從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn).同時(shí)，生長(zhǎng)與生產(chǎn)解偶聯(lián)可以很好地避免有毒中間體的積累或?qū)?xì)胞有毒性的酶的過量表達(dá)，抑制合成毒性中間體的上游途徑并在適當(dāng)時(shí)間激活利用它的下游產(chǎn)物合成途徑，從而更好地平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。
5結(jié)論與展望
微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控在高效生物制造過程中有舉足輕重的作用，構(gòu)建優(yōu)化模式微生物底盤細(xì)胞高效合成食品功能因子已取得一定的進(jìn)展，幾種功能性低聚糖、多種有機(jī)酸、氨基酸、維生素以及植物活性成分等均通過調(diào)控相應(yīng)底盤細(xì)胞的生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物有效合成(表2).快速有效地生長(zhǎng)和高效地產(chǎn)物合成是微生物底盤細(xì)胞的兩個(gè)重要特性，但由于細(xì)胞資源分配的局限性、異源途徑與細(xì)胞代謝競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致的代謝通量失衡和代謝異質(zhì)性等問題會(huì)嚴(yán)重影響微生物細(xì)胞工廠的生長(zhǎng)特性，進(jìn)而降低其合成性能.基于合成生物學(xué)原理和技術(shù)已開發(fā)出多種通過調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)改善生物合成的策略，通過碳源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白工程和適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化提高底盤細(xì)胞的生長(zhǎng)速率;通過調(diào)控NADH供給、F0F 1 ATP合酶的表達(dá)以及電子傳遞鏈以重編程細(xì)胞能量代謝;構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)缺陷系統(tǒng)、開發(fā)基于群體質(zhì)量控制和代謝產(chǎn)物成癮系統(tǒng)使得細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成偶聯(lián);構(gòu)建化合物誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)和群體感應(yīng)系統(tǒng)將細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成解偶聯(lián)，這些策略在優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)可以有效增強(qiáng)產(chǎn)物的合成.而進(jìn)一步提升細(xì)胞生長(zhǎng)速率或挖掘具有更好生長(zhǎng)潛能的新型微生物宿主，優(yōu)化適應(yīng)性進(jìn)化方法以及完善動(dòng)態(tài)調(diào)控工具將更好地促進(jìn)高效合成食品功能因子細(xì)胞工廠的構(gòu)建。
基于微生物的生長(zhǎng)調(diào)控高效合成食品功能因子已取得重大進(jìn)展，但仍然存在一些亟待解決的問題.目前已有多種策略可以有效提高底盤細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，但由于細(xì)胞自身的局限和代謝負(fù)擔(dān)等問題，工程菌株的生長(zhǎng)可能會(huì)仍低于野生型菌株，阻礙其工業(yè)應(yīng)用.再者，目前研究對(duì)象主要局限于模式微生物底盤細(xì)胞，因此挖掘生長(zhǎng)性能更優(yōu)的微生物對(duì)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的高效合成具有重大意義.隨著新的微生物不斷被發(fā)現(xiàn)，需要評(píng)估其生長(zhǎng)代謝能力和產(chǎn)品合成效率.目前，一種快速生長(zhǎng)的微生物——需鈉弧菌(Vibrio natriegens)已被分離得到，其倍增時(shí)間小于10 min[131]并且相應(yīng)的遺傳操作工具[132~134]也已被開發(fā)，因此該菌株作為潛在的微生物合成平臺(tái)具有遠(yuǎn)大前景，但該菌株作為合成食品功能因子細(xì)胞工廠的潛能仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，因?yàn)槿魏芜m用于食品合成的微生物底盤細(xì)胞的安全性最為重要。
動(dòng)態(tài)調(diào)控可以有效減弱或避免傳統(tǒng)代謝工程改造策略造成的細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)、中間代謝物或有毒物質(zhì)積累、輔因子失衡和細(xì)胞生長(zhǎng)受損等問題.但目前開發(fā)的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件數(shù)量不多，且元件響應(yīng)的靈敏性、正交性和穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步優(yōu)化.對(duì)此，可利用不同的調(diào)控元件構(gòu)建邏輯線路，高效精細(xì)地調(diào)控代謝流;也可通過定向進(jìn)化優(yōu)化已有元件的響應(yīng)性能，或者挖掘和開發(fā)新型調(diào)控元件.為了進(jìn)一步擴(kuò)展細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控方法的適用范圍并且避免胞內(nèi)代謝物干擾的問題，Liu團(tuán)隊(duì)[135]引入了基于密碼子擴(kuò)展的正交翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在代謝流調(diào)控和細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)鍵酶中插入非天然氨基酸(ncAA)，并通過精確調(diào)控必需基因的表達(dá)來精準(zhǔn)控制代謝流量和細(xì)胞生長(zhǎng).應(yīng)用該策略，研究人員分別在基因組重編碼的E.coli中將N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量提高了4.5倍，在基因組未重編碼的B.subtilis中將燕窩酸產(chǎn)量提高了2.2倍，為創(chuàng)建生長(zhǎng)與代謝精準(zhǔn)可控的高版本底盤細(xì)胞提供了新策略.但該策略仍存在成本較高、難以大規(guī)模應(yīng)用的問題，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化.總之，基于系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的代謝工程策略發(fā)展迅速，對(duì)微生物的各種機(jī)制進(jìn)行深入挖掘，開發(fā)各種工具調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，為實(shí)現(xiàn)食品功能因子的高效、綠色、穩(wěn)定合成提供了潛力。
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