小反芻獸疫病毒生長曲線繪制及生長特性分析
將含高滴度小反芻獸疫病毒的新鮮病料研磨后接種VERO DS細胞系進行病毒分離，出現細胞病變后連續傳代，取3代以上培養物，進行RT-PCR和間接免疫熒光試驗及生長曲線測定。生長曲線測定分別以0.01和0.1 MOI接種VERO DS細胞，每隔12h測定病毒滴度，連續培養168h，繪制病毒生長曲線，分析生長特性。結果顯示，病料接種細胞72h后，出現細胞病變，經RT-PCR和間接免疫熒光試驗鑒定為小反芻獸疫病毒；生長特性研究顯示，0.01和0.1 MOI兩種病毒接種量，病毒滴度最高均為106 TCID50左右，但峰值出現時間和下降速度存在差異，0.01 MOI接種量出現峰值晚，但是維持高滴度時間較長。本文成功分離一株小反芻獸疫病毒，并對兩種接毒量的生長特性差異進行了初步分析，為探索該病毒培養方法和收毒時間提供了借鑒。
小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）又稱小反芻獸假性牛瘟、肺腸炎、口炎肺腸炎綜合征等，是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起，臨床以發熱、口炎、腹瀉和肺炎為主要特征的綿羊和山羊的一種急性、高度接觸性傳染病，發病率和死亡率最高可分別達到100%和90%[1，2]。世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病，是《國家中長期動物疫病防治規劃（2012—2020年）》重點防控的13種外來動物疫病之一。該病于1942年在非洲西部的象牙海岸科特迪瓦首次暴發，2007年[3]和2013年先后傳入我國西藏和新疆部分地區，并在其他多地出現PPR疫情。
PPRV與牛瘟病毒（RPV），犬瘟熱病毒（CDV）、海豹瘟病毒（PDV）、海豚瘟病毒（DDV）、牛麻疹病毒（MV—K1）和人麻疹病毒（MV）等同為副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbolivirus）成員[4]?；蚪M為單股負鏈、無節段RNA[5]。其RNA鏈從3'到5'端依次為編碼N-P-M-F-H-L蛋白的基因[5]。目前該病毒僅有一個血清型，從遺傳演化上，根據F基因分析可分為四個族系，IV系主要分布在中東和西亞，我國發生的PPR疫情也為IV系[3，6]。
本研究將患病羊的組織病料接種VERO DS細胞，分離出一株PPRV，經RT-PCR和間接免疫熒光實驗確認后，對0.1和0.01 MOI病毒接種量的生長特性進行了研究，結果表明不同接種劑量條件下，病毒具有不同的增殖曲線。本研究對于如何分離PPRV具有一定實踐意義，此外，還揭示了用VERO DS細胞進行病毒增殖時，接毒劑量與增殖、病毒活力之間的關系，為PPRV的培養提供了參考。
1、材料與方法
1.1主要儀器和試劑
Hettich MIKRO 220R低溫臺式離心機；Olympus倒置熒光顯微鏡；Heraeus CO2培養箱；杭州博日Gene Max PCR儀；Count Star細胞計數儀；DMEM購自life公司；胎牛血清購自Hyclone公司；VERO DS細胞為本實驗室保存；High pure viral RNA kit購自ROCHE公司；PPRV特異性單克隆抗體和VERO DS細胞為本實驗室保存；PPRV常規RT-PCR檢測方法為本實驗室建立。
1.2 VERO DS細胞的準備
取生長狀態良好的VERO DS細胞進行常規傳代，待細胞覆蓋細胞瓶底70%時，PBS洗2次，備用。
1.3病料采集與處理
采集發病期間死亡羊的脾臟，充分剪碎后加入10倍量的Hank's液，研磨器中研磨成乳劑，以3 000 r/min離心沉淀10 min后取上清液，0.2μm孔過濾除菌，備用。
1.4病料接種
將處理好的病料上清液按培養液體積的1/10接種VERO DS細胞系，置37℃培養箱內吸附，1h后棄去上清，PBS洗2次，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，于37℃5%CO2培養箱培養，同時設未接病料對照，每天觀察細胞病變情況。
1.5病毒鑒定
1.5.1 RT-PCR檢測細胞出現病變后，連續傳三代，取第三代病毒液200μL，用ROCHE公司High pure viral RNA kit提取病毒RNA，并用PPRV特異性檢測引物進行RT-PCR擴增。
1.5.2免疫熒光檢測將病毒接種于長滿單層VERO DS細胞的96孔板，置5%CO2培養箱37℃培養，待病變達60%～70%時，吸凈培養液，用PBS洗滌一次，加入95%的甲醇固定10min。棄掉固定液，敞開培養板使其自然干燥。加0.5%Triton室溫作用15 min。用PBS將PPRV特異性單克隆抗體1:2 000稀釋后加入培養板，40μL/孔，37℃振搖孵育1 h。PBST洗滌三次，每孔加入40μL 1:100稀釋的FITC標記山羊抗鼠IgG，37℃振搖孵育1 h，PBST洗滌三次，加90%甘油50μL。熒光倒置顯微鏡下觀察。
1.5.3生長曲線測定測定第三代病毒液TCID50，用細胞計數儀測定細胞濃度，分別以0.01 MOI和0.1 MOI[7]接種VERO DS細胞各14瓶，每隔12h取出1瓶-70℃凍存，用于檢測病毒滴度，連續培養7天。分別測定14瓶細胞的TCID50，繪制病毒生長曲線。
2、結果與分析
2.1病毒分離與CPE觀察結果
鏡下觀察發現，接毒后第3天可見細胞發生融合，形成多個大小不等的合胞體（圖1）。第4天，病變細胞呈現拉網狀，繼之出現大片脫落（圖2）。連續傳至第3代，每代可見相同的CPE。將該分離毒命名為PPRV-S。
2.2病毒的RT-PCR鑒定
用PPRV特異性引物進行RT-PCR擴增，結果顯示，在300bp左右出現特異性條帶，大小與預期相符，將擴增產物送交生工測序，核酸片段為PPRV特異性核酸片段（圖3）。
2.3免疫熒光檢測結果
間接免疫熒光檢測顯示，在接種PPRV-S分離毒的細胞孔發現綠色熒光，陰性對照孔未發現綠色熒光（圖4），表明該分離毒可被PPRV特異性單克隆抗體識別。
圖1細胞融合形成合胞體
圖2細胞病變脫落呈拉網狀
圖3 PPRV的RT-PCR鑒定結果
圖4免疫熒光檢測（400×）
2.4 TCID50檢測結果
不同接毒時間TCID50的檢測結果顯示，病毒接種細胞后病毒滴度首先出現一定程度下降，在12-24h病毒滴度最低，之后開始快速升高，36-60h達到峰值，兩種病毒接種量的最高TCID50為接近106TCID50/mL，之后緩慢下降。接毒168h后，病毒滴度仍能達到103-104TCID50/mL（圖5）。
不同病毒接種量TCID50檢測結果顯示，0.1 MOI接種量在接種后36h即可達到病毒滴度峰值，0.01 MOI接種量則在60h病毒滴度峰值。就出現后的下降速度而言，0.1 MOI接種量出現峰值后滴度迅速下降，84h后病毒滴度降低至104TCID50/mL以下，而0.01 MOI接種量出現峰值雖然較晚，但直至接毒132 h后病毒滴度才下降至104TCID50/mL以下；兩者在接毒168h后，病毒滴度基本相同，為103.5TCID50/mL左右（圖5）。
圖5 PPRV-S的TCID50變化曲線
3、討論
PPRV是一種有囊膜的單股RNA病毒，在2007年首次傳入我國西藏，時隔6年又傳入我國新疆地區。據OIE網站提供資料，除新疆外，該病2014年在我國多個省、市、自治區相繼發生，防控形勢極為嚴峻。多角度研究PPRV相關特性，為PPR防控提供技術支持很有意義。
目前用于分離病毒的細胞為VERO細胞系和VERO DS細胞系。研究發現，病毒在感染細胞的過程中，SLAM蛋白是介導病毒進入細胞的主要受體，促使病毒囊膜與細胞膜發生融合，進而使病毒粒子進入細胞內部[8]。VERO DS細胞系因在細胞表面存在犬SLAM受體，提高了病毒的分離效率，因此理論上說，VERO DS細胞系比VERO細胞系更適合用于PPRV分離，但是由于羊和犬的SLAM蛋白同源性不到70%，所以VERO DS細胞系仍不是用于PPRV分離的最佳細胞。由于本實驗室沒有細胞表面存在的羊SLAM蛋白的細胞系，所以用VERO DS細胞進行PPRV分離。
由于PPRV對環境的抵抗力非常弱，50℃60分鐘即可被滅活，陽光照射也容易將病毒滅活[7，9]。現實工作中，從對發病羊采集樣品到運送至實驗室進行病毒分離往往需要幾天甚至更長時間，這時的樣品雖然用RT-PCR仍能檢測出高含量的病毒核酸，但病毒往往已經不具有感染性，不適合進行病毒分離。因此，一旦確定采樣的目的是分離病毒，需要在采集樣品后及時冷凍保存并盡快送至實驗室進行病毒分離，避免反復凍融和在室溫下放置太長時間。此外，運輸過程中也要保持低溫。同時，還需要盡量選擇病毒含量高的組織樣品用于病毒分離，以提高分離效率。但需要注意的是，由于腸組織中含有大量的酶類成份，容易對細胞產生影響，不太適合用于病毒分離。
本研究除分離到一株PPRV外，還繪制了分離毒的生長曲線。通過對接毒后168h的觀察發現，病毒接種后24h內，病毒滴度出現下降，可能由于病毒粒子進入細胞內，但還未產生具有感染性的新的病毒。24h至36h是病毒的對數繁殖期，這一時期有大量的新病毒被釋放出來，之后病毒滴度開始出現緩慢降低或維持一定水平。本文采用了兩個病毒接毒劑量，0.1MOI和0.01MOI，其中0.1MOI孔出現病毒滴度峰值的時間明顯早于0.01MOI組，但之后迅速下降。而0.01MOI組雖然出現峰值的時間明顯晚于0.1MOI組，但卻略高于0.1MOI組，而且能夠在較高的滴度維持較長的時間。兩種接毒劑量在168h均有一定的感染力。這一研究對于PPR疫苗研究和生產過程中何時收獲病毒液有一定借鑒意義。由于目前我國使用的PPR疫苗為弱毒疫苗，因此如何保證生產過程中活毒效價非常重要?？紤]到實際生產過程中無法對每個批次進行不同時間點的TCID50測定，作者建議采用能使病毒在高滴度維持較長時間的0.01MOI接種劑量。需要說明的是，本文只研究了PPRV在VERO DS細胞系上的生長曲線，如果了解在VERO細胞上的生長特性，還需要另外進行相關研究。