短梗霉素A對植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因的抑制生長機理（一）
通過考察短梗霉素A(Ab A)對灰葡萄孢菌野生株Bc AUR1及其AUR1基因內含子缺失突變株Bc AUR1a生長的影響，明確Ab A抑制真菌生長的機理。Ab A敏感性試驗表明，低濃度Ab A(8μg/m L)顯著抑制野生株Bc AUR1菌體的生長，高濃度Ab A(50μg/mL)存在下觀察不到Bc AUR1的生長跡象。突變株Bc AUR1a則不受Ab A的影響，在低濃度和高濃度Ab A存在下均能正常生長。Ab A抑制Bc AUR1侵染柑橘果實，但Bc AUR1a在高濃度Ab A存在下也能夠有效感染柑橘果實。這兩個試驗均證實了突變株Bc AUR1a具有Ab A抗性。電鏡觀察表明，Ab A引起Bc AUR1細胞質膜和內膜系統形態異常，質膜和液泡膜斷裂，細胞內物質泄露。Ab A抑制灰葡萄孢菌生長的機制是由于IPC合成酶受到抑制，導致鞘磷脂類物質合成不足，細胞膜結構破壞，胞內物質外漏。
灰霉病由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起，是一種世界范圍內的農作物及果蔬病害。灰葡萄孢菌的寄主范圍很廣，能侵染多種糧食作物、蔬菜、水果和觀賞植物的葉、莖、花和果實。灰霉病不僅在田間造成危害，而且在貯運、銷售和消費期間繼續造成果蔬發病腐爛，嚴重影響產品產量和質量，造成很大的經濟損失。目前化學防治仍然是灰霉病防治的主要措施，但由于灰葡萄孢菌具有遺傳變異大、繁殖速率快和適應性強等特性，連續多年大量使用單一作用位點的殺菌劑，很容易形成對特定殺菌劑具有抗性的亞群體，其結果是防治效果下降，甚至失效。灰葡萄孢菌主要侵染果蔬的可食部分，殺菌劑的廣泛使用，帶來各種問題，如農藥殘留導致人畜安全受到威脅，傷害環境中其他微生物引起生態平衡失調等。人們一直試圖尋找一種對真菌高效、與已有藥劑沒有交互抗性、對人類安全的新型殺菌劑。
鞘脂是真核生物細胞膜結構的重要成分，是維持真核細胞結構不可缺少的組分。近年來越來越多的研究表明，鞘脂及其代謝產物還是重要的信號分子，參與膜蛋白的定位和運輸，并調節細胞的生長、分化、凋亡、衰老等基本生命活動。在鞘脂合成途徑中，哺乳動物鞘脂類合成最終形成鞘磷脂，植物中形成復雜神經鞘脂質，而真菌最終形成甘露糖基化的肌醇磷酸神經酰胺。因此，神經酰胺和磷脂酰肌醇生成肌醇磷脂酰神經酰胺(IPC)和甘油二酯的反應是真菌鞘脂合成所特有的(圖1)。催化這一反應的酶，肌醇磷脂酰神經酰胺合成酶(IPC合成酶)是鞘脂代謝中的關鍵酶，可作為篩選抗真菌藥物的靶標。
圖1不同生物中鞘脂代謝途徑
短梗霉素A(aureobasidin A，Ab A)是從出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)R106培養液中分離得到的環狀九肽抗生素，對真菌和原生動物的生長有廣譜抑制作用。現已證實Ab A是真菌AUR1基因編碼的IPC合成酶的非競爭性抑制劑。Ab A處理和AUR 1基因表達抑制均引起酵母細胞形態和組織結構變化，如微管消失、細胞周期循環阻滯，細胞膜和內膜系統完整性遭到破壞等。通過在酵母等真菌中篩選抗Ab A突變體，發現突變體能抵抗Ab A引起的細胞形態和生長發育的異常，酵母AUR1基因158位的苯丙氨酸(Phe)突變為酪氨酸(Tyr)是獲得Ab A抗性的分子機制。
迄今，對植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因在生長發育過程中的作用了解甚少，本試驗通過研究Ab A對灰葡萄孢菌及其突變體生長的影響，明確Ab A抑制真菌生長的機理，為真菌的防治和開發新型抗真菌藥物提供理論依據。
1、材料與方法
1.1供試材料
1.1.1菌株
灰葡萄孢菌原始菌株Bc AUR1由浙江大學農業與生物技術學院李紅葉教授實驗室惠贈。灰葡萄孢菌突變菌株Bc AUR1a由本實驗室以Bc AUR1為原始菌株，通過紫外誘變，Ab A篩選獲得，經鑒定和序列測定發現，該突變菌株AUR 1基因序列中缺失117～231位115 bp的內含子序列，但AUR1基因編碼的IPC合成酶的氨基酸序列未發生突變。
1.1.2培養基和Ab A母液配制
含Ab A的PDA培養基：待滅菌PDA培養基涼至50℃，依次加入Amp(終濃度為100μg/m L)和Ab A，使Ab A終濃度分別為2、8和50μg/m L，混勻后鋪板;以相應濃度的甲醇代替Ab A，作為對照PDA培養基。
Ab A母液：Ab A購自寶生物公司，用甲醇配成濃度為2 mg/m L的母液，存儲在4℃冰箱中，備用。
其他所有試劑均為分析純。
1.2試驗方法
1.2.1灰葡萄孢菌的培養
保存菌種用平板畫線法接種于PDA培養基上，28℃恒溫倒置培養一周，待其菌絲變為灰色并產生孢子，無菌水洗下孢子，調整孢子的濃度為1×107個/m L，4℃保存備用。
1.2.2灰葡萄孢菌對Ab A的敏感性測定
將野生型灰葡萄孢菌及其突變體的孢子懸浮液分別取100μL接種于對照平板和含不同濃度Ab A的PDA平板上培養6 d，觀察菌落生長狀況。
1.2.3灰葡萄孢菌侵染柑橘試驗
先用清水將柑橘表面洗干凈，然后在超凈臺中依次用無菌水、70%乙醇清洗，晾干。將柑橘分為4組，每組10個。用無菌針在柑橘表皮上刺1個1 mm左右的傷口，試驗組在傷口表面均勻涂布5μL 50μg/m L的Ab A，晾干。對照組均勻涂布5μL2.5%甲醇。分別將5μL Bc AUR1和Bc AUR1a的孢子懸液(1×107個/m L)均勻涂布于對照組和試驗組柑橘傷口處，置于保濕器皿中，室溫(20±2)℃下培養4 d，觀察感染情況。
1.2.4 Ab A對灰葡萄孢菌細胞形態的影響
分別將灰葡萄孢菌Bc AUR1孢子懸液接種于含8μg/m L Ab A的PDA平板和對照平板上，25℃培養3 d。用2.5%的戊二醛溶液4℃固定過夜，按常規透射電鏡樣品制備方法制備樣品。將制備好的樣品在Reichert超薄切片機中切片，獲得70～90 nm的薄片，經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色15 min后，在日本JEOL公司生產的JEM-1230型透射電鏡中觀察、拍照。
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短梗霉素A對植物病原真菌灰葡萄孢菌AUR 1基因的抑制生長機理（二）
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