枯草芽孢桿菌BC80-6發(fā)酵培養(yǎng)基、生長條件及對煙草根黑腐病菌生防作用（一）
枯草芽孢桿菌是一類好氧性革蘭氏陽性細菌。在自然界分布廣泛，對環(huán)境友好，是土壤和植物微生態(tài)中的優(yōu)勢微生物種群。枯草芽孢桿菌抗逆性較強，具有很好的抗菌防病作用，可防治多種植物病害。枯草芽孢桿菌BS916可以在番茄根部有效定殖，是其在田間防治番茄青枯病的重要保障。利用枯草芽孢桿菌XF-1來抑制白菜根腫病菌的侵染和繁殖。枯草芽孢桿菌G3不僅能較好的防治菜豆和茄子苗期的炭疽病和菌核病，同時還能防治番茄的葉霉病，防效達78.8%。黎起秦等發(fā)現(xiàn)內(nèi)生枯草芽孢桿菌B47對番茄青枯病的防效可達79.79%。利用內(nèi)生枯草芽孢桿菌T295較好的控制了煙草根黑腐病的發(fā)生。由于枯草芽孢桿菌具有穩(wěn)定的定殖能力和適應(yīng)能力，使其具有巨大生存空間的競爭優(yōu)勢，從而能有效發(fā)揮其抗菌防病作用。但由于在引入新拮抗枯草芽孢桿菌時，需要打破原來的生態(tài)平衡，且拮抗枯草芽孢桿菌的定殖較為復(fù)雜和困難，這就使很多拮抗菌的生防效果不穩(wěn)定。
枯草芽孢桿菌BC80-6（Bacillus subtilis，BC80-6）是低能離子束注入誘變獲得的拮抗菌，具有較強的廣譜性，對煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）具有一定的生防作用。為此，探究了3種BC80-6菌株處理液對煙草根黑腐病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用，再以菌株BC80-6活菌含量為指標，優(yōu)化菌株BC80-6的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，并開展田間控病防效試驗，旨在為建立煙草根黑腐病的綠色防控體系提供依據(jù)。
1、材料與方法
1.1、材料和試劑
1.1.1材料
烤煙品種為云煙97，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。枯草芽孢桿菌BC80-6（Bacillus subtilis，BC80-6）和煙草根黑腐病菌[Thielaviopsis basicola（Berk.et br.）Fer.]均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院病理研究室分離、鑒定與保存。
1.1.2試劑
葡萄糖、乳糖、淀粉、甘油、麥芽糖、酵母浸出物、牛肉膏、尿素、氯化銨、大豆蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、NaCl、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnCl2（合肥沐辰生物技術(shù)有限公司），70%甲基托布津可濕性粉劑（河北冠龍農(nóng)化有限公司），80%多菌靈可濕性粉劑（江蘇泰倉農(nóng)化有限公司）。
1.2、方法
1.2.1培養(yǎng)液制備
將枯草芽孢桿菌BC80-6在NA培養(yǎng)基上活化48 h后，接入50 mL的NB培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，進行活菌液、過濾液和高溫滅菌液的制備。①活菌液：將培養(yǎng)液4 000 r/min離心15 min后棄上清液，沉淀中加入無菌水混勻后，4 000 r/min離心15 min后棄上清液，重復(fù)上述步驟1次，獲得濃度為1×108 cfu/mL的活菌液。②過濾液：將培養(yǎng)液先用0.22μm的微孔濾膜過濾，將過濾后的溶液8 000 r/min離心30 min，離心后獲得的上清液即為過濾液。③高溫滅菌液：將過濾液經(jīng)121℃滅菌20 min，獲得高溫滅菌液。
NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉20 g，水1 L。
NB培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，水1 L。
1.2.2生長抑制率的測定
病原菌菌碟的制備：挑取一小塊病原菌接入PDA平板中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。用直徑為4 mm的打孔器沿菌落邊緣打取菌碟，將菌碟接入PDA平板中央，25℃培養(yǎng)9 d，再用直徑為4 mm的打孔器沿菌落邊緣打取菌碟，備用。
將活菌液、過濾液、高溫滅菌液分別按1:10、1:100、1:500進行稀釋，制備成3種PDA培養(yǎng)基。在3種培養(yǎng)基中分別接入病原菌菌碟，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d觀察一次。不加任何處理液的培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次。9 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計算不同培養(yǎng)液對菌絲生長的抑制率。
菌絲生長抑制率=（對照組菌落平均直徑-處理組菌落平均直徑）/對照組菌落平均直徑×100%
1.2.3孢子萌發(fā)抑制率的測定
將煙草根黑腐病病原菌接入PDA平板中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后，配制孢子懸浮液（濃度為2×105個/mL）。將活菌液、過濾液、高溫滅菌液分別按1:20、1:200、1:1 000進行稀釋，再分別與孢子懸浮液按1:1的比例進行混合。取150μL的混合液滴于凹玻片中，置于培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。無菌水處理為對照，每個處理重復(fù)3次。6 h后觀察孢子的萌發(fā)情況，每個處理鏡檢300個孢子，并計算不同處理液濃度對煙草根黑腐病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率。
孢子萌發(fā)抑制率=（對照組孢子萌發(fā)平均數(shù)-處理組孢子萌發(fā)平均數(shù)）/對照組孢子萌發(fā)平均數(shù)×100%
1.2.4培養(yǎng)基成分的優(yōu)化
種子液的配制。將枯草芽孢桿菌BC80-6接種在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，用接種環(huán)蘸取活化后的菌種，接入裝有25 mL種子培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，氯化鈉10 g，水1 L，pH 7.0）的三角瓶中，28℃、180 r/min黑暗振蕩培養(yǎng)36 h。
碳源的優(yōu)化。分別用1%葡萄糖、1%乳糖、1%淀粉、1%甘油和1%麥芽糖（W/V）等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖，制成不同碳源培養(yǎng)基。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（蔗糖10 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 L，pH 7.0）為對照。按5%的接種量分別接入裝有25 mL不同碳源培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，160 r/min、28℃下黑暗振蕩培養(yǎng)。24 h后測定不同碳源培養(yǎng)基中活菌含量（活菌含量即1 mL培養(yǎng)基中所含枯草芽孢桿菌的數(shù)量，cfu/mL），每個處理重復(fù)3次。根據(jù)不同碳源培養(yǎng)基中的活菌含量確定最佳碳源。
氮源的優(yōu)化。分別用1%酵母浸出物、1%牛肉膏、1%尿素、1%氯化銨、1%大豆蛋白胨（質(zhì)量體積比）替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。按5%的接種量接入分別裝有25 mL不同氮源培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，160 r/min、28℃條件下黑暗振蕩培養(yǎng)，24 h后測定不同氮源培養(yǎng)基中的活菌含量，每個處理重復(fù)3次。根據(jù)不同氮源培養(yǎng)基中的活菌含量確定最佳氮源。
無機鹽的優(yōu)化。根據(jù)微生物對大量元素與微量元素不同的利用情況，在不同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.5%NaCl、0.5%K2HPO4、0.5%NaH2PO4、0.05%MgSO4、0.05%CaCl2、0.005‰FeSO4、0.005‰MnCl2（質(zhì)量體積比），基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。按5%的接種量接入裝有25 mL不同無機鹽培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，160 r/min、28℃條件下黑暗振蕩培養(yǎng)，24 h后測定不同無機鹽培養(yǎng)基中的活菌含量，每個處理重復(fù)3次。根據(jù)不同無機鹽培養(yǎng)基中的活菌含量確定最佳無機鹽種類。
通過氮源、碳源、無機鹽3個單因素試驗，篩選出最佳氮源、碳源、無機鹽的種類。設(shè)置最佳氮源含量（A）、最佳碳源含量（B）、最佳無機鹽含量（C）3個因素處理，每個因素分別設(shè)置3個水平，按L9（33）正交設(shè)計進行試驗。
1.2.5發(fā)酵條件的優(yōu)化
生長曲線的測定。將活化的枯草芽孢桿菌BC80-6接入1.2.4節(jié)中確定的最優(yōu)培養(yǎng)基中，25℃發(fā)酵培養(yǎng)，每3 h取1次菌液，測定菌液OD600，共培養(yǎng)48 h。未接菌的培養(yǎng)基為空白對照。以時間為橫坐標，菌體OD600為縱坐標，繪制枯草芽孢桿菌的生長曲線。
培養(yǎng)溫度的優(yōu)化。搖床溫度設(shè)定為25、28、30、33、35、37、40℃，將BC80-6接到50 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)24 h后，測定活菌含量并繪制圖表。
培養(yǎng)液初始pH值的優(yōu)化。優(yōu)化培養(yǎng)基的初始pH設(shè)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0，將BC80-6接入不同pH、50 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h后，測定活菌含量并繪制圖表。
接種量的優(yōu)化。按1%、3%、5%、7%、9%（體積比）的接種量將BC80-6分別接入到50 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h后，測定活菌含量并繪制圖表。
轉(zhuǎn)速的優(yōu)化。搖床轉(zhuǎn)速分別調(diào)節(jié)為120、140、160、180、200、220 r/min，將BC80-6接入到50 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h后，測定活菌含量并繪制圖表。
裝液量的優(yōu)化。在5個250 mL三角瓶中，分別裝入20、40、60、80和100 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基，按照最適接種量將BC80-6接入到培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h后，測定活菌含量并繪制圖表。
1.2.6田間防控效果調(diào)查
BC80-6發(fā)酵液和病原菌孢子懸浮液的制備。根據(jù)搖瓶培養(yǎng)優(yōu)化的發(fā)酵條件，用40 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)BC80-6至菌液濃度為1×108 cfu/mL，用于灌根施藥。將煙草根黑腐病原菌接入PDA培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)9 d。用無菌水沖洗PDA平板上的病原菌，制備濃度為106~107個/mL的孢子懸浮液。
在安徽省宣城市黃渡鄉(xiāng)選擇土壤肥力較好的地塊作為試驗田。于2017年3月14日進行大田移栽，煙苗移栽兩周后進行接種。用滅菌的剪刀斜切煙草根部造成傷口，取20 mL孢子懸浮液灌于煙株根部。接種后10 d進行灌根施藥，每株煙苗200 mL發(fā)酵液。同時設(shè)70%甲基托布津可濕性粉劑、80%多菌靈可濕性粉劑和清水為對照。每個處理20株煙草，共3次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。施藥后第20天，按照GB/T 23222—2008進行病害調(diào)查及分級，并計算發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果，用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。
枯草芽孢桿菌BC80-6發(fā)酵培養(yǎng)基、生長條件及對煙草根黑腐病菌生防作用（一）
枯草芽孢桿菌BC80-6發(fā)酵培養(yǎng)基、生長條件及對煙草根黑腐病菌生防作用（二）