利用細菌生長曲線表征芳樟醇對三文魚莓實假單胞菌MS 02的抑菌效果（二）
2結(jié)果與分析
2.1α多樣性分析結(jié)果
對單樣本的α多樣性分析可以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。由表1可知，5個樣品的微生物覆蓋率（Coverage）均為1.000，說明該測序結(jié)果鑒定了三文魚片中絕大多數(shù)細菌的系統(tǒng)類別。檢測結(jié)果表明，從0～12 d的樣品觀察到的細菌OTUs數(shù)量分別為121、104、125、135、128。以Shannon、Simpson、Chao1及Ace指數(shù)對樣品的菌群豐富度和多樣性進行初步評估。Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)用于估算樣品中微生物的多樣性，Shannon越大，群落多樣性越高，Simpson指數(shù)則相反；而Chao1指數(shù)及Ace指數(shù)常用于估算樣品的菌群豐度，是OTUs豐度的其他估計量。表中數(shù)據(jù)顯示Shannon指數(shù)逐日增加，而Simpson指數(shù)則相反，說明樣品的微生物多樣性逐漸增多；而Chao1及ACE指數(shù)均高于每個相應(yīng)樣本的OTUs觀察數(shù)則表明在所有樣品中可能還存在一些額外的微生物門類。
表1不同貯藏時間三文魚微生物群落的α多樣性指數(shù)
基于OTUs分析制作三文魚樣品的Venn圖，不同的橢圓代表不同組樣品，重疊部分的數(shù)字代表樣本間共有的OTUs個數(shù)，單獨的數(shù)字代表樣本特有OTUs個數(shù)。由圖1可知，整個貯藏期間三文魚OTUs總數(shù)為210個，其中5組樣品共有的有56個，占總數(shù)的26.67%；第0天（S0d）OTUs數(shù)量為121個，占總數(shù)的57.62%；第3天（S3d）OTUs數(shù)量為104個，占總數(shù)的49.52%；第6天（S6d）OTUs數(shù)量為125個，占總數(shù)的59.52%；第9天（S9d）OTUs數(shù)量為135個，占總數(shù)的64.29%；第12天（S9d）OTUs數(shù)量為128個，占總數(shù)的60.95%。第0天特有的OTUs數(shù)量為10個，占總數(shù)的4.76%；第3天特有的OTUs數(shù)量為4個，占總數(shù)的1.90%；第6天特有的OTUs數(shù)量為10個，占4.76%；第9天特有的OTUs數(shù)量為11個，占總數(shù)的5.24%；第12天特有的OTUs數(shù)量為12個，占總數(shù)的5.71%。圖中各橢圓均與其他組橢圓有重疊的部分，表明各組樣品的細菌物種之間互有交叉，圖1證明了在貯藏期間的三文魚細菌群落是動態(tài)變化的。
圖1三文魚樣品細菌群落Venn圖
2.2細菌相對豐度分析結(jié)果
分別從門、綱、目、科、屬、種6個水平對三文魚4℃貯藏期間的細菌群落相對豐度進行分析，結(jié)果如圖2所示。貯藏期間三文魚的細菌優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）；優(yōu)勢菌綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）；優(yōu)勢菌目為弧菌目（Vibrionales）和假單胞菌目（Pseudomonadales）。在科水平的優(yōu)勢菌為弧菌科（Vibrionaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）。
三文魚4℃貯藏期間屬水平的優(yōu)勢菌為發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、青枯菌屬（Ralstonia）和不動桿菌屬（Acinetobacter），相對豐度為97%，其中貯藏前期發(fā)光桿菌屬的細菌在整個菌相系統(tǒng)中處于優(yōu)勢地位，相對豐度為84.89%；而隨著時間的延長，假單胞菌屬、青枯菌屬、不動桿菌屬的細菌相對豐度均呈現(xiàn)上升的趨勢，其中假單胞菌屬的細菌相對豐度上升趨勢最為明顯，在貯藏初期相對豐度為3.98%，到第12天時相對豐度高達31.46%，并且仍有上升的趨勢。此外菌相系統(tǒng)中還存在一些如紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）等細菌。而在整個貯藏期間Pseudomonas fragi增長速度最快，在第0、3、6、9、12天相對豐度分別為3.01%、4.89%、11.20%、21.99%、24.82%。
圖2三文魚細菌群落不同分類水平的相對豐度
2.3優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定結(jié)果
將1.3.2節(jié)分離、純化后得到菌株進行DNA提取和PCR擴增，測定擴增產(chǎn)物的基因序列并與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的微生物基因序列進行BLAST比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇與已知的微生物基因序列同源性最高且活性最強（活化培養(yǎng)至對數(shù)生長期時菌體濃度最高）的菌株，將其命名為MS 02。如圖3所示，16S rRNA分析結(jié)果證明MS 02為莓實假單胞菌。后續(xù)實驗均以莓實假單胞菌MS 02為靶細菌。
圖3菌株MS 02與其他假單胞菌之間的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.4芳樟醇對莓實假單胞菌的抑菌活性
芳樟醇對水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌——莓實假單胞菌的抑菌活性如表2所示。當(dāng)芳樟醇質(zhì)量濃度為1.00μg/mL時，莓實假單胞菌的OD595 nm為0.268±0.014，與陽性對照組無顯著性差異（P＞0.05），但略高于陽性對照組，因此芳樟醇對莓實假單胞菌的MIC為2.00μg/mL。圖4顯示了芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02生長的影響，在細菌生長過程中，菌懸液中的細菌濃度與OD595 nm呈正相關(guān)，因此能夠通過莓實假單胞菌OD595 nm表征細菌的生長狀況。由圖4可知，空白對照組莓實假單胞菌呈指數(shù)型增長，說明溶劑中的甲醇對細菌生長無明顯影響。加入MIC和2 MIC的芳樟醇后，細菌生長明顯受到抑制，MIC組的OD595 nm僅在培養(yǎng)后期有略微增長，可能是因為芳樟醇劑量較低，且培養(yǎng)時其易揮發(fā)導(dǎo)致的。
圖4芳樟醇對莓實假單胞菌生長的影響
2.5莓實假單胞菌的微觀形貌觀察結(jié)果
采用芳樟醇處理后的莓實假單胞菌的微觀形貌如圖5所示，未添加芳樟醇的莓實假單胞菌（圖5A）的菌體形態(tài)呈完整且表面光滑的桿狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)添加芳樟醇后，菌體表面隨著芳樟醇添加量的增大出現(xiàn)不同程度的破裂，MIC和2 MIC芳樟醇處理的莓實假單胞菌如圖5B、C所示，圖5B中菌體表面變得粗糙且不完整，細胞膜產(chǎn)生明顯的凹陷褶皺，圖5C中的菌體形態(tài)被嚴重破壞，細胞膜幾乎完全破裂，內(nèi)容物溶出。上述結(jié)果表明芳樟醇能破壞莓實假單胞菌的細胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外泄，從而抑制菌的生長。植物精油因具有疏水性更易作用于細菌細胞膜，破壞胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，從而抑制細菌生長。
圖5芳樟醇處理后的莓實假單胞菌SEM圖
2.6芳樟醇對莓實假單胞菌電導(dǎo)率的影響
圖6反映了芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02電導(dǎo)率的影響，當(dāng)細菌細胞膜被抑菌劑損害時，細胞膜的半透性喪失，胞內(nèi)電解質(zhì)大量流出，抑制細菌生長。空白對照組菌液電導(dǎo)率變化不明顯，這表明體系中的甲醇不會破壞細胞膜的通透性；加入MIC和2 MIC芳樟醇的菌液電導(dǎo)率迅速上升，表明芳樟醇對莓實假單胞菌的細胞膜有明顯破壞作用，細胞膜破損、電解質(zhì)流出導(dǎo)致菌液電導(dǎo)率的上升。
圖6芳樟醇對莓實假單胞菌電導(dǎo)率的影響
2.7芳樟醇對莓實假單胞菌細胞膜通透性的影響
FDA是一種自身無熒光且不帶電荷的脂質(zhì)性分子，在胞內(nèi)可被酶水解為熒光素發(fā)出熒光，當(dāng)細胞膜受到破壞，熒光素流失從而導(dǎo)致FDA熒光強度降低。因此，細菌細胞膜的通透性可通過FDA熒光強度來反映。圖7中顯示的是相同處理時間不同處理條件的FDA熒光強度，50%甲醇處理的熒光強度為1 920 AU，MIC和2 MIC組的熒光強度分別為530、211 AU，可以看出添加芳樟醇的處理組其熒光強度明顯低于對照組，這表明50%甲醇不能改變細菌細胞膜的通透性。但隨著芳樟醇質(zhì)量濃度增加，細菌細胞膜被破壞程度逐漸明顯，2 MIC處理組的熒光強度最低，這表明2 MIC芳樟醇處理能明顯破壞莓實假單胞菌的細胞膜，這與圖5中2 MIC組菌體形態(tài)被嚴重破壞，細胞膜幾乎完全破裂的結(jié)論一致。舒慧珍等在探究檸檬烯對熒光假單胞菌細胞膜通透性的影響時也得到了類似的結(jié)論。
圖7芳樟醇對莓實假單胞菌FDA熒光強度的影響
2.7芳樟醇對莓實假單胞菌細胞膜完整性的影響
細胞膜的完整性是菌體正常生長代謝的重要影響因素，其受到破壞會導(dǎo)致膜內(nèi)的DNA和RNA等物質(zhì)泄漏，DNA和RNA在260 nm波長處具有強吸收作用，故可用菌懸液在OD260 nm的變化反映細菌細胞膜的完整性。如圖8所示，在反應(yīng)3 h后，含芳樟醇組菌懸液中的OD260 nm迅速升高，而空白對照組變化不明顯，這與上文的結(jié)論相一致，說明PCL不會引起細菌細胞膜的破裂。MIC和2 MIC的芳樟醇會使莓實假單胞菌細胞膜在短時間內(nèi)破裂，內(nèi)容物迅速流失，對細菌細胞有較明顯的破壞作用。張赟彬等發(fā)現(xiàn)肉桂醛會使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細胞膜完整性被破壞，內(nèi)容物迅速釋放導(dǎo)致菌液在260 nm波長處的光密度值增大，本實驗結(jié)果與其一致。
圖8芳樟醇對莓實假單胞菌細胞膜完整性的影響
2.8芳樟醇對莓實假單胞菌胞內(nèi)酶的影響
鈉鉀ATP酶是一種蛋白酶，存在于組織細胞及細胞器膜上，能維持跨膜離子濃度梯度，測定胞內(nèi)鈉鉀ATP酶的活力變化可以分析抑菌劑對細菌細胞能量代謝的影響。由圖9可知，在培養(yǎng)6 h后，空白對照組的鈉鉀ATP酶活力最大，而MIC和2 MIC芳樟醇組的鈉鉀ATP酶活力都相對較小，且明顯可以看出芳樟醇添加量與胞內(nèi)鈉鉀ATP酶活力有直接聯(lián)系。這表明芳樟醇能有效抑制莓實假單胞菌細胞內(nèi)鈉鉀ATP酶的活力，影響細胞的正常能量代謝。胡文杰等研究表明油樟葉精油的幾種餾分單體也能使尖孢鐮刀菌內(nèi)ATP酶活力下降。
圖9芳樟醇對莓實假單胞菌胞內(nèi)酶活力的影響
AKP存在于細胞壁和細胞膜之間，一般難以在胞外被檢測到，但當(dāng)細胞結(jié)構(gòu)被破壞后，AKP會泄漏至細胞外。因此，可通過檢測細菌胞外的AKP活力變化來觀察其對細胞壁的破壞情況。由圖9可知，在培養(yǎng)6 h后，空白對照組AKP活力最高，說明50%甲醇對莓實假單胞菌的細胞壁結(jié)構(gòu)無影響。但添加MIC和2 MIC芳樟醇后，莓實假單胞菌AKP活力降低，這表明芳樟醇的加入會使莓實假單胞菌的細胞壁被破壞，導(dǎo)致菌體電解質(zhì)外泄，最終抑制菌體生長，且隨著芳樟醇添加量的增加，AKP活力降低越明顯。
3結(jié)論
本實驗采用HTS分析4℃貯藏期間三文魚的菌相結(jié)構(gòu)，并分離提取出1株三文魚優(yōu)勢腐敗菌——莓實假單胞菌MS 02，再深入探究芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02的抑菌機理。4℃貯藏三文魚的微生物群落多樣性與演替規(guī)律會隨著時間延長而變化。三文魚的優(yōu)勢菌屬為發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬、青枯菌屬和不動桿菌屬。貯藏期間三文魚菌相發(fā)生極大地變化，各菌群之間相互競爭，假單胞菌屬的相對豐度隨著時間的延長逐漸增大，莓實假單胞菌是樣品在貯藏期間的增長速率最快的菌種。芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02具有良好的抑菌效果，SEM結(jié)果表明芳樟醇能使細菌細胞膜產(chǎn)生凹陷褶皺，而電導(dǎo)率、OD260 nm、FDA熒光強度和AKP、鈉鉀ATP酶活力結(jié)果則證明了芳樟醇能破壞莓實假單胞菌的細胞膜和細胞壁的通透性和完整性，影響細菌細胞正常能量代謝，導(dǎo)致菌體死亡。
利用細菌生長曲線表征芳樟醇對三文魚莓實假單胞菌MS 02的抑菌效果（一）
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