不同條件下裂片石莼水培液的組成成分對耐藥弧菌株的抑菌作用（二）
1、材料與方法
1.1實驗材料
裂片石莼(Ulva fasciata)購自于廣東省汕頭市南澳島(117°02′E，23°42′N)，清洗干凈后置于人工海水(1 kg海水素溶于28.5 L純水，鹽度為35，海水素購自青島海之鹽水族科技有限公司)中適應性培養2 d。為減少細菌的影響，用抗生素(0.75 mg/L多黏菌素、0.75 mg/L氯霉素、0.9 mg/L新霉素和100 mg/L氨芐青霉素)處理48 h。
為獲得不同密度海藻分泌物水培液，稱取上述新鮮裂片石莼1.25 g、2.5 g、5 g、10 g和分別置于1 L滅菌后的人工海水中培養(光強為(200±25)μmol/m2/s，光周期為24 h光照:0 h黑暗，25℃下持續曝氣)。收集培養1 d和3 d的水培液，通過0.22μm的無菌濾膜過濾后儲存在無菌離心管中用于后續實驗。
用于分離弧菌的養殖水、沉積物和養殖動物樣品分別從浙江省舟山市普陀區朱家尖的白蝦、南美白對蝦和菲律賓蛤仔3種不同海水養殖場中采集。
藥敏紙片:頭孢唑林(Cefazolin)、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢西丁(Cefoxitin)、阿莫西林(Amoxicillin)、氨芐青霉素(Ampicillin)、哌拉西林(Piperacillin)、左氧氟沙星(Levofloxacin Tablets)、美羅培南(Meropenem)、亞胺培南(Imipenem)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、阿米卡星(Amikacin)、卡那霉素(Kanamycin)、復方新諾明(Sulfamethoxazole)、慶大霉素(Gentamycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、四環素(Tetracycline)、鏈霉素(Streptomycin)，以上全部購自于杭州微生物試劑有限公司。實驗藥劑鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP)、乙縮醛(Acetal)、2-(4-羥基苯)乙醇(p-HPEA)和2，4，6-三溴苯酚(TBP)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢唑啉和哌拉西林購于上海源葉生物科技有限公司。
1.2弧菌分離鑒定和耐藥性表征
1.2.1弧菌分離鑒定
取10 mL水樣轉移到40 mL 3%NaCl堿性蛋白胨水(APW)中;取10 g沉積物加入10 mL人工海水并離心(4 000 r/min，10 min);將蝦、蛤仔內部組織肉經研磨后加入10 mL蒸餾水離心(4 000 r/min，10 min)，將上清液加入到3%NaCl APW中，并在37℃條件下培養24 h獲得不同的菌懸液。采用平板劃線分離法，將菌懸液用接種環沾取至硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽汁酸鹽蔗糖瓊脂(TCBS)和法國科瑪嘉培養基(CHROMagar?)上純化鑒定，經多次劃線分離后獲得較純的菌株。將分離菌株按照國家標準方法GB 4789.7-2013進行生化鑒定，并進一步進行DNA提取和16S rDNA測序以鑒定菌種。
1.2.2分離弧菌耐藥性表征
參考臨床和實驗室標準化協會推薦的紙片擴散法檢測分離弧菌對各種常見抗生素的耐藥性。用無菌棉拭蘸取0.5麥氏濁度(1.0×108 CFU/mL)的菌懸液涂布于Mueller-Hinton瓊脂平板表面，再將抗生素藥敏紙片貼至平板上，37℃培養24 h后測量抑菌圈的直徑大小并判斷其藥物敏感(sensitive，S)、中介(intermediate，I)及耐藥(resistant，R)水平(表1)。
表1弧菌對各抗生素的耐藥程度對應的抑菌圈直徑
抗生素抑菌圈直徑/mm
敏感(S)中介(I)耐藥(R)
阿莫西林≥18 14~17≤13
氨芐青霉素≥17 14~16≤13
頭孢唑林≥18 15~17≤14
哌拉西林≥21 18~20≤17
美羅培南≥16 14~15≤13
阿米卡星≥17 15~16≤14
氨芐青霉素≥23 15~22≤14
頭孢西丁≥18 15~17≤14
卡那霉素≥18 14~17≤13
頭孢他啶≥18 15~17≤14
環丙沙星≥21 16~20≤15
左氧氟沙星≥17 14~16≤13
慶大霉素≥15 13~14≤12
亞胺培南≥16 14~15≤13
氯霉素≥18 13~17≤12
鏈霉素≥15 12~14≤11
復方新諾明≥16 11~15≤10
四環素≥19 15~18≤14
1.3裂片石莼水培液對弧菌的抑制特性
1.3.1裂片石莼水培液對弧菌生長的抑制性能實驗
采用改良后的紫外分光光度法檢測弧菌的生長情況。將分離的弧菌轉移到3%NaCl胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中培養獲得菌懸液，通過稀釋分別獲得1.0×105 CFU/mL和1.0×103 CFU/mL的稀釋液，用酶標儀在600 nm處每隔1 h測定吸光度，計算不同弧菌24 h內的生長變化，以無弧菌的3%NaCl TSB溶液作為空白對照，設置3組平行。
分別取9 mL不同密度的裂片石莼水培液于不同試管中作為實驗組，加入1 mL弧菌菌懸液(1×105 CFU/mL);陽性組為9 mL的人工海水和1 mL相同濃度的弧菌菌懸液;分別以9 mL的不同密度裂片石莼水培液和人工海水作為實驗組和陽性組的陰性對照，并加入1 mL滅菌的3%NaCl TSB溶液。所有組別均設置3個生物學重復，在37℃恒溫培養箱中培養12 h測定OD600nm值。弧菌抑制率計算公式為:
其中I為弧菌抑制率(%)，A為對照組弧菌OD600 nm，B為實驗組弧菌OD600 nm，C為陽性組OD600 nm，D為陽性組的陰性對照OD600 nm，E為實驗組OD600 nm，F為實驗組的陰性對照OD600 nm。
1.3.2水培液成分分析
利用固相萃取(Waters OAsis HLB固相萃取柱)將過濾后的裂片石莼水培液和人工海水濃縮到固相小柱中，控制流速低于5 mL/min，每根固相小柱通過2 L樣品溶液。加樣結束后，使用30 mL超純水進行淋洗以洗去柱內雜質，繼續使用真空泵抽干1 h。取10 mL甲醇加至固相小柱中洗脫，分3~4次進行，最后將洗脫液通過旋轉蒸發儀(35℃)濃縮至1 mL，0.22μm過濾除菌后備氮氣吹干。加入80μL甲氧銨鹽酸鹽吡啶溶液(15 mg/mL)渦旋2 min后于37℃下進行90 min肟化反應，再加入80μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)衍生試劑，渦旋2 min后于70℃反應1 h，室溫靜置30 min，采用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)進行檢測。
GC-MS分析儀器為8890B-5977B氣相色譜質譜聯用儀(Agilent，USA)，進樣量為1μL，分流比為10∶1，色譜柱為DB-5MS毛細管柱。進樣口溫度260℃，載氣為高純氦氣，程序升溫60~310℃，質譜儀電子轟擊能量70 eV。GC-MS的原始文件通過MassHunter workstation Quantitative Analysis(v10.0.707.0)進行搜庫鑒定及數據預處理，將質譜信息與代謝數據庫(主要為Fiehn database等商業數據庫以及自建的數據庫)進行匹配，根據質譜匹配度鑒定代謝物并予以分析。
1.3.3裂片石莼水培液主要成分對弧菌的最小抑菌
采用微量肉湯稀釋法檢測代謝物對弧菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，同時以抗生素阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢唑啉和哌拉西林對弧菌的MIC為參照。在96孔板中通過二倍稀釋法得到不同濃度水培液代謝物和抗生素的稀釋液，將100μL稀釋液與等量菌懸液(1.0×105 CFU/mL)于37℃培養24 h后，以孔內完全澄清，且濃度最低孔的濃度為MIC。
1.4統計分析
方差分析(ANOVA)用于估計統計學上的顯著差異，單樣本t檢驗用于比較樣本均值與總體均值之間的差異(IBM SPSS Statistics 26.0)，P<0.05為顯著差異。使用Origin 2021繪制主成分分析(PCA)，將PC1和PC2繪制在一起，根據數據在空間某一方向的投影值的距離進行比較分析，以確定不同培養時間和密度下的海藻水培液的化合物成分差異。
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