不同包裝方式下清蒸大黃魚(yú)貯藏過(guò)程中PH值、菌落總數(shù)、菌群等的變化情況（一）
摘要：探究不同包裝方式對(duì)清蒸大黃魚(yú)貯藏過(guò)程中品質(zhì)及菌群的影響。基于理化性質(zhì)及高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定不同包裝方式下清蒸大黃魚(yú)貯藏過(guò)程中的汁液流失率、pH值、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反應(yīng)物值、揮發(fā)性成分、菌落總數(shù)和微生物群落的變化。結(jié)果表明：相比于普通包裝，真空包裝和氣調(diào)包裝均可有效抑制清蒸大黃魚(yú)貯藏過(guò)程中TVB-N含量的上升，真空包裝可以最大程度抑制貯藏過(guò)程中清蒸大黃魚(yú)的脂質(zhì)氧化，而氣調(diào)包裝可以最大程度抑制微生物的生長(zhǎng)；清蒸大黃魚(yú)貯藏后關(guān)鍵揮發(fā)性成分為己醛、辛醛、壬醛、癸醛、庚醇、2-十一酮，其中氣調(diào)包裝的清蒸大黃魚(yú)風(fēng)味優(yōu)于普通包裝和真空包裝；清蒸大黃魚(yú)貯藏后的菌群多樣性下降，其中革蘭氏陰性菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)，優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門和擬桿菌門；在屬水平上，普通包裝組優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜冷桿菌和不動(dòng)桿菌，氣調(diào)包裝組為不動(dòng)桿菌與無(wú)色桿菌，真空包裝組為不動(dòng)桿菌、希瓦氏菌和假單胞菌。本研究可為大黃魚(yú)加工貯藏中包裝方式的選擇提供參考。
大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）俗名黃花魚(yú)、黃金龍等，與帶魚(yú)、小黃魚(yú)、烏賊并列為我國(guó)傳統(tǒng)四大海產(chǎn)。大黃魚(yú)作為我國(guó)沿海特有的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，海水養(yǎng)殖產(chǎn)量居全國(guó)第一，2022年全國(guó)養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)25.7萬(wàn)t，其中福建總產(chǎn)量達(dá)21.5萬(wàn)t。隨著人們生活水平不斷提高，生活節(jié)奏加快，方便、營(yíng)養(yǎng)的水產(chǎn)食品越來(lái)越受到青睞，市場(chǎng)潛力巨大。清蒸大黃魚(yú)可作為即食水產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，其大致經(jīng)過(guò)原料挑選、預(yù)處理、腌制調(diào)味、蒸制及冷卻的工藝流程。然而，大黃魚(yú)在清蒸后若未及時(shí)食用或妥善貯藏，極易因微生物活動(dòng)和生理生化反應(yīng)導(dǎo)致品質(zhì)下降甚至腐敗。因此，探索有效的貯藏方法以保持清蒸大黃魚(yú)的品質(zhì)和安全性至關(guān)重要。
包裝方式是影響魚(yú)類貯藏品質(zhì)的關(guān)鍵因素，不同的包裝技術(shù)如真空包裝、氣調(diào)包裝等已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮。這些技術(shù)通過(guò)調(diào)整包裝內(nèi)的氣體成分，控制氧氣、二氧化碳和其他氣體的比例，旨在減緩微生物生長(zhǎng)速率，延緩腐敗過(guò)程，延長(zhǎng)保質(zhì)期。目前市面上常見(jiàn)的包裝方式有普通包裝、真空包裝和氣調(diào)包裝等，因作用機(jī)制不同，用于不同包裝對(duì)象所展現(xiàn)出的效果有所差異。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有不少學(xué)者研究比較了不同包裝方式對(duì)畜肉、禽肉、生鮮水產(chǎn)等肉類貯藏過(guò)程中品質(zhì)的影響。另外，已有研究表明氣調(diào)包裝對(duì)大黃魚(yú)鮮品貯藏品質(zhì)有積極影響，但不同包裝方式對(duì)清蒸大黃魚(yú)品質(zhì)及菌群的影響仍不清楚。
因此，本研究通過(guò)測(cè)定清蒸大黃魚(yú)的汁液流失率、pH值、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、揮發(fā)性成分、菌落總數(shù)及菌群的變化情況，探究不同包裝方式下清蒸大黃魚(yú)貯藏過(guò)程中的理化性質(zhì)與菌群變化規(guī)律，為清蒸大黃魚(yú)運(yùn)輸及銷售過(guò)程中的貯藏條件、包裝方式的科學(xué)選擇提供參考依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
冰鮮大黃魚(yú)購(gòu)于永輝超市。
聚乙烯（polyethylene，PE）自封袋（食品級(jí)）佛山市凡人包裝有限公司；真空袋福州旺客包裝材料有限公司；2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）（純度98%）上海麥克林生化科技有限公司；氧化鎂（純度98%）、三氯乙酸（純度98%）、乙二胺四乙酸（純度≥99.5%）、氯化鈉（純度≥99.5%）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KG203-03快速DNA提取檢測(cè)試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒美國(guó)Axygen公司。
1.2儀器與設(shè)備
電子分析天平；BS224S型手持pH計(jì)；T18型高速離散均質(zhì)機(jī)；DQ320L-V型氣調(diào)保鮮包裝機(jī)；Kjeltec 8420型凱氏定氮儀；GR85DA型立式滅菌鍋；GSP-9160MBE型隔水培養(yǎng)箱、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱；AWCJ-1B型標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(tái)；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)；TQ8050型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀；HP-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；μCount3D微生物立體計(jì)數(shù)儀 丹麥BioSense公司。
1.3方法
1.3.1樣品制備
將冰鮮大黃魚(yú)去頭尾、去內(nèi)臟，洗凈瀝干，魚(yú)肉在100℃沸水清蒸4 min，靜置冷卻后，分別進(jìn)行普通包裝（PE自封袋）、真空包裝和氣調(diào)包裝（N2、CO2體積比6∶4），放入4℃冰箱中進(jìn)行貯藏實(shí)驗(yàn)，0～24 d貯藏期間，每隔6 d將3種包裝方式下的樣品各隨機(jī)取出3個(gè)，恢復(fù)至室溫后，測(cè)定樣品各項(xiàng)指標(biāo)，以未經(jīng)貯藏的清蒸大黃魚(yú)作為對(duì)照組。
1.3.2汁液流失率測(cè)定
貯藏之初，稱量包裝袋的質(zhì)量。貯藏期檢測(cè)時(shí)，擦干恢復(fù)至室溫的包裝袋上的水漬后，稱取包裝袋、汁液和魚(yú)肉的總質(zhì)量，小心撕開(kāi)包裝袋，取出魚(yú)肉，再稱量包裝袋和汁液的總質(zhì)量，貯藏過(guò)程中的汁液流失率按式（1）計(jì)算：
式中：m0為包裝袋質(zhì)量/g；m1為包裝袋、汁液和魚(yú)肉的總質(zhì)量/g；m2為包裝袋與汁液的總質(zhì)量/g。
1.3.3 TVB-N含量測(cè)定
參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定魚(yú)肉的TVB-N含量。
1.3.4 pH值測(cè)定
稱取10 g魚(yú)肉放入燒杯中，加入50 mL蒸餾水，用均質(zhì)機(jī)以5 000 r/min均質(zhì)2 min后，在室溫下靜置30 min，離心后取上清液，測(cè)定pH值。
1.3.5 TBARS值測(cè)定
將魚(yú)肉研碎后，稱取10 g樣品放入錐形瓶中，再加入50 mL含0.1 g/100 mL乙二胺四乙酸的7.5 g/100 mL三氯乙酸溶液，置于加熱至70℃的振蕩器中振蕩30 min，取出靜置冷卻后過(guò)濾，取上清液5 mL加入0.02 mol/L TBA溶液，在90℃的水浴鍋中加熱45 min，取出靜置冷卻至室溫后，加入5 mL氯仿，充分混勻，靜置至溶液分層。分別在532 nm和600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液吸光度。TBARS值按式（2）計(jì)算：
1.3.6揮發(fā)性成分測(cè)定
取2.0 g樣品移入20 mL頂空瓶中，快速密封。將固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）纖維頭在GC-MS進(jìn)樣口老化（250℃）至無(wú)雜峰。將樣品瓶置于SPME裝置，60℃水浴加熱10 min；將SPME纖維頭插入樣品的頂空部分，推出纖維頭，60℃水浴萃取30 min；抽回纖維頭，從樣品瓶中拔出，插入GC-MS儀進(jìn)樣口，進(jìn)行GC-MS分析。
G C條件：H P-5 M S柱（3 0 m×0.2 5 m m，0.25μm），載氣：氦氣，流量1.30 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：50℃保持2 min，以4℃/min升至160℃，以20℃/min升至280℃，保持2 min。MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～550，GC-MS接口溫度280℃，離子源溫度200℃。
定性與定量分析：與NIST 2008和Wiley質(zhì)譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜比對(duì)，對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定性，僅正反匹配度均大于800的物質(zhì)才予以保留；根據(jù)色譜圖保留峰面積計(jì)算各個(gè)揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。
關(guān)鍵揮發(fā)性成分分析：采用相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）評(píng)價(jià)揮發(fā)性成分對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)。確定對(duì)樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的ROAVstan＝100，其他揮發(fā)性成分的ROAV按式（3）計(jì)算：
式中：Cstan為對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大成分的相對(duì)含量/%；Tstan為對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大成分的感覺(jué)閾值/（μg/kg）；Ci為待測(cè)成分相對(duì)含量/%；Ti為待測(cè)成分的感覺(jué)閾值/（μg/kg）。
ROAV≥1，說(shuō)明該成分對(duì)樣品總體風(fēng)味起關(guān)鍵性作用，ROAV值越大，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大；0.1≤ROAV＜1，說(shuō)明該成分對(duì)樣品總體風(fēng)味起重要修飾作用。
1.3.7菌落總數(shù)計(jì)算
參照GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》方法計(jì)算菌落總數(shù)。
1.3.8菌群的高通量測(cè)序
選擇清蒸大黃魚(yú)不同部位進(jìn)行取樣，混勻，采用十六烷基三甲基溴化銨法提取魚(yú)肉樣品DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA的完整性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。其中，PCR擴(kuò)增體系選用ProTaq、20μL反應(yīng)體系：2×ProTaq聚合酶10μL，前引物（5μmol/L）和后引物（5μmol/L）各0.8μL，10 ng/μL模板DNA 1μL，添加ddH2O至20μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，每個(gè)樣品各循環(huán)29次；最后在72℃下終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取3μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確保擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶大小正確、濃度合適。
使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫；再次用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè)，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例混合與Illumina測(cè)序。根據(jù)物種分類數(shù)據(jù)庫(kù)https://www.arb-silva.de/，采用USEARCH11-uparse算法按相似度97%進(jìn)行分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，分類置信度0.7。
1.4數(shù)據(jù)處理
每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，通過(guò)Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入，使用IBM SPSS Statistics 26對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，組間差異顯著性水平設(shè)定為P＜0.05，采用Origin 2021制圖。
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