不同濃度條件下微藻計數方法：流式細胞儀VS血球計數板計數
摘要：為了探討流式細胞儀對不同濃度條件下微藻個數進行計數的準確度和精密度，該文應用流式細胞儀和血球計數板計數兩種方法，對水體中的赤潮異灣藻數目進行不同濃度梯度的檢測對比分析，可以發現，流式細胞儀計數結果的RSD值均小于5%，體現了更好的精密度，是一種可以代替血球計數板計數的快速準確的方法。
細胞計數是醫學、環境科學和生物學等領域研究中的重要環節。其在了解細胞生長狀態、密度測定、環境監測等方面具有十分重要的作用和影響。用于檢測單細胞微藻的方法多采用血球計數板法，但該方法費時費力，重現性較差。為了提高檢測效率以及檢測結果的準確度和精密度，本文嘗試利用流式細胞儀計數法，選取微型浮游植物赤潮異彎藻，通過用血球計數板計數法和流式細胞儀計數法對不同濃度梯度的微藻溶液進行計算值和實測值的對比分析，驗證流式細胞儀對微藻計數的準確度和精密度。
1材料與方法
1.1試驗材料和儀器
流式細胞儀染色劑Guava ViaCount（Merck Millipore），血球計數板（MARIENFELD），流式細胞儀（Partec CyFlow Cube），光學顯微鏡（XSP-8CA，上海），圓周振蕩器（Vortex 3，IKA）。
1.2試驗方法
1.2.1血球計數板計數法
取1 mL微藻懸液于離心管，加入160?L4%的戊二醛，震蕩搖勻后靜置5 min。試驗中采用25×16格的血球計數板在顯微鏡下對稀釋后的微藻懸液進行計數。
其計算公式如下：單細胞微藻數/mL=80小格內微藻個數/80×400×104×稀釋倍數。
1.2.2流式細胞儀計數法
取適量微藻培養液于離心管中振蕩均勻，從中移取400?L藻液至3.5 mL樣品管，加入適量染色劑振蕩混勻并避光存放30 min，取海水稀釋待測液至1.2 mL，混勻過濾后即可使用流式細胞儀進行計數。
其計算公式如下：單細胞微藻數/mL=儀器讀出的活體微藻數/測樣體積×1000×稀釋倍數。
2結果與討論
2.1流式細胞儀的精確度分析
該文采用了傳統的血球計數板計數對比流式細胞儀計數，每種方法重復3次，取平均值，兩種計數方法所得到的平均值非常接近，但是血球計數板多次計數所得到的各項數值偏離平均值的程度較大，其相對標準偏差RSD約為5%，而流式細胞儀精確度較好，其相對標準偏差RSD為2%，Eva L.Joachimsthal和Yingying Wang也在研究中提到了流式細胞儀的標準偏差都小于5%，能得到比較可信的結果。
2.2流式細胞儀的準確度分析
實驗設置了幾組不同的濃度梯度，對異灣藻進行實驗，根據測出的原始初樣濃度，進行相應稀釋度的理論計算和流式細胞儀計數，如圖1所示，不同稀釋度的計算值和實際測量值的相對標準偏差大都小于2%，擬合度比較好，說明流式細胞儀計數的精確度很高，從圖中也可以看出，在不同稀釋度下的計算值和實際測量值之間的差值也非常小，表明流式細胞儀計數的準確度良好。
3結語
通過兩種計數方法的對比分析可以看出，流式細胞儀計數具有較高的準確度和精密度，解決了傳統方法計數中活體藻游動和取樣過程帶來的隨機性問題，計數過程簡便快捷，更適合實際應用。
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