耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌生長曲線測定及對線蟲毒力作用（三）
2.4線蟲生存曲線
在沒有抗生素存在的情況下，用攜帶不同耐藥基因的菌株感染線蟲后，繪制線蟲的生存曲線(圖5)，采用Log-rank檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析，與對照組(中位生存時間為9 d)相比，blaKPC組、blaKPC+blaNDM組和blaIMP+blaOXA組的生存曲線右移，中位生存時間為10 d，菌株對線蟲的毒力作用減弱(P=0.009 2、0.022、0.001 7);blaIMP+blaNDM組生存曲線左移，中位生存時間為8 d，表明菌株對線蟲的毒力作用增強，差異具有統計學意義(P=0.0064);其余各組中位生存時間為9 d，與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，菌株毒力未表現出增強或減弱。
圖5耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對線蟲毒力作用比較
3討論
CRKP作為目前臨床耐碳青霉烯類腸桿菌科(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)感染的主要病原菌，是臨床感染的治療與控制面臨的重大挑戰。本研究通過細菌生長曲線及線蟲毒力模型，探究攜帶不同碳青霉烯類耐藥基因的CRKP菌株對環境的適應性和對線蟲毒力作用的影響，闡述不同碳青霉烯類耐藥基因的潛在風險，補充我國CRKP的分子流行特征，為CRKP的爆發流行和感染控制提供理論依據。
本研究通過在不同濃度抗生素壓力下測試各菌株的生長曲線來研究耐藥基因對CRKP適應性的影響。結果顯示，攜帶有blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株，在沒有抗生素的情況下生長速度與其他組沒有明顯差異;在抗生素存在的情況下，尤其是高濃度抗生素(8 mg/mL)下，生長速度明顯高于其他組，說明攜帶blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株在抗生素環境中適應性更強，這或許是由于其對抗生素的耐受、水解能力增強，將有助于其在抗性環境中增殖與傳播。而攜帶blaOXA的菌株，在高濃度抗生素存在的情況下，生長明顯被抑制，這可能是由于其對亞胺培南的水解作用較弱所導致的。所以攜帶不同的耐藥基因會產生不同的適應性效應，在菌株的生長速度和細菌總量上體現出不同的效果。攜帶blaKPC和blaKPC+blaNDM的菌株在抗生素環境中表現出的較強種群生長增殖能力，使得他們更為廣泛傳播，而攜帶其他耐藥基因的菌株在高濃度抗生素下生長較弱，所以只是零星爆發。
本研究通過線蟲侵染模型探究不同碳青霉烯類耐藥基因對菌株毒力的影響。結果顯示，在沒有抗生素的情況，攜帶blaKPC、blaKPC+blaNDM和blaIMP+blaOXA耐藥基因的菌株感染線蟲后，線蟲中位生存時間較其他組有所延長，說明對線蟲的毒力作用相較于其他菌株更低，而D′Apolito、McLaughlin等的研究結果也表明攜帶blaKPC會使菌株毒力降低，本文研究結果與其一致。雖然毒力減弱或許更利于臨床感染的控制與治療，但是隨著近年來的高毒力耐藥株被報道，攜帶blaKPC的耐藥株的毒力作用也在逐漸增強，高毒力耐藥株的出現也將為臨床帶來新的挑戰。在感染blaNDM+blaIMP菌株后，線蟲中位生存時間有所縮短，說明其毒力作用增強了。攜帶blaNDM、blaIMP、blaOXA、blaNDM+blaOXA與對照組相比差異無統計學意義，說明菌株毒力并沒有表現出增強或者減低。G?ttig和Liu等研究結果表明攜帶blaNDM并不會增強菌株的毒力，Jia等的研究結果表明其為低毒力菌株，本研究結果與其一致。而攜帶blaKPC的菌株毒力強于blaOXA菌株這一點在本研究中并沒有得到證實，與Mil-Homens等的研究結果有差異。
碳青霉烯類耐藥基因一般位于大型質粒上，由于質粒之間存在相互作用，所以攜帶單個耐藥質粒與攜帶多個耐藥質粒所帶來的適應性和毒力作用不同。在細菌生長曲線測試結果可以看出，攜帶多個耐藥質粒最終對細菌適應性的影響似乎有加乘效應。在抗生素存在時，單獨攜帶blaKPC或blaNDM的菌株生長適應性都較強，同時攜帶blaKPC和blaNDM的菌株表現出了強于單獨攜帶時的適應性。而且在blaIMP和blaOXA組也能觀察到相似的效應:同時攜帶blaIMP和blaOXA的菌株比單獨攜帶blaIMP或blaOXA的菌株表現出了更強的適應性，生長速度和細菌總量明顯高于單獨攜帶的菌株。但是在線蟲毒力模型中，攜帶雙抗性質粒的菌株，毒力作用的改變并不是兩個耐藥質粒毒力作用的簡單加乘或拮抗效果，由于本研究涉及樣本量較小，雙耐藥質粒對毒力作用的影響規律和作用機制還需要更進一步研究。
值得注意的是，結合耐藥基因與ST分型數據，本研究發現在本研究中所有ST11型菌株都恰好攜帶了blaKPC抗性基因。攜帶blaKPC基因所帶來的低毒力效應及高濃度抗生素壓力下的強適應性、強增殖能力，可能正是導致ST11型菌株成為我國CRKP的主要流行克隆株。
適合度代價是指在沒有選擇壓力的情況下，攜帶耐藥質粒的菌株相較于沒有該質粒的菌株表現出來的生長緩慢、競爭力減弱和(或)毒力減低等現象。本研究發現無抗生素時，blaKPC組和blaKPC+blaNDM組菌株對線蟲的毒力作用有所降低，說明這兩組菌株可能存在一定的適合度代價。這可能是由于獲得耐藥質粒為宿主菌帶來了額外的DNA復制負擔，從而對細菌細胞的復制速率產生了負面影響，生長增殖速度降低;菌株在提高環境適應性的同時，通過降低自身毒力，以減輕宿主菌的代謝負擔，利于菌株的增殖與傳播。在選擇壓力存在的條件下，攜帶有耐藥質粒的菌株優勢就得以彰顯，將會表現出更高的環境適應性和更強的抗生素耐受能力。本研究中這兩組菌株在抗生素存在時顯示出明顯的生長優勢，也印證了適應性代價的存在。Li等研究也證實了blaKPC基因的表達會帶來適應性代價，對菌株產生負面影響。對于blaKPC+blaNDM雙抗性菌株，臨床報道并不多，在Gao等研究中，利用大腸桿菌EC600作為受體菌，獲得的雙抗性轉化株并不存在適應性代價，與本研究所采用雙抗性原始分離株進行測試的結果不符，這可能是因為耐藥質粒存在宿主菌依賴性。Di等研究表明blaKPC在CRKP和在E.Coli中的適應度成本不一樣，說明質粒-宿主菌的相互作用是特異性的，不同遺傳背景的宿主菌基因表達會影響質粒基因的表達，這或許可以解釋為什么本研究中blaKPC+blaNDM雙抗性菌株存在適應性代價，而Gao等的研究中卻有不一樣的結果。
4結論
攜帶不同的碳青霉烯類耐藥基因會對CRKP菌群產生不同的適應性影響和毒力作用。了解臨床分離株的耐藥基因攜帶情況及既往抗生素使用史，有助于了解菌群的生長增殖狀態和毒力情況，從而更有針對性的選擇抗生素，并在不同的時間節點上調整抗生素用量，更好的控制感染。
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