芐嘧磺隆降解菌株75B的生長曲線、生長及降解（一）
芐嘧磺隆是一種磺酰脲類除草劑，被廣泛應用于稻田土壤中防除一年生和多年生闊葉雜草。在土壤中的持效期較長，大量施用后易對后茬敏感作物產生藥害，微生物降解是土壤中芐嘧磺隆轉化的主要方式。本研究從長期施用該除草劑的稻田土壤中分離篩選到1株芐嘧磺隆降解菌株75B，經形態學及生理生化特征、16S rRNA基因擴增測序構建系統發育樹分析，鑒定為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。75B菌株對環境的適應能力較強，在pH 5.09.0、0.55.0%NaCl濃度下、培養溫度為2638℃的范圍內生長良好。將該菌株按5%接種量置于pH 7.0、以芐嘧磺隆為唯一碳源的無機鹽培養基(2.0%NaCl濃度)中、34℃條件下培養，對50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率為74.11%，培養至10 d時的降解率為97.65%。結果表明75B菌株可以有效地降解芐嘧磺隆，具有應用于該除草劑污染環境修復的潛力。
芐嘧磺隆(Bensulfuron-methyl，BSM)是一種磺酰脲類除草劑，可以抑制乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)的活性，導致植物支鏈氨基酸的合成受阻而起殺草作用。由于其選擇性高，對禾本科植物無害，因而被廣泛應用于稻田土壤中防除一年生和多年生闊葉雜草和莎草。芐嘧磺隆具有揮發性低、難以光降解，在堿性土壤中的持效期長達100 d以上的特征。大量應用后不僅對后茬輪作作物有毒、損傷煙草和番茄等敏感作物，而且其殘留可通過滲濾增加鄰近水生環境污染的可能性。研究已經證明BSM對水生蕨類和淡水藍藻有高度毒性。較高濃度(3.553 mg/kg)BSM的處理可造成土壤微生物多樣性降低，嚴重抑制需氧性細菌、固氮菌、纖維素分解菌及氨化細菌的生長，減少了土壤固氮過程和硝化作用的進行；還可導致Pseudomonasputida(惡臭假單胞菌)的急性毒性效應。然而，利用14C標記技術對施加芐嘧磺隆的稻田土壤進行降解研究，發現重復施用BSM的稻田土壤中礦化產生14CO2的速率更快，表明土壤細菌可以利用BSM為碳源和能源；顯然，通過微生物酶系統發揮的微生物降解仍然是芐嘧磺隆在土壤中轉化的決定性機制。但是，自2005年首次分離到可以降解芐嘧磺隆的Brevibacteriumsp.BH菌株后，近年來芐嘧磺隆的降解微生物報道仍較少。
為了豐富芐嘧磺隆的降解菌株，本研究從長期施用芐嘧磺隆除草劑的農田土壤中，分離篩選到1株Klebsiellapneumoniae，并對其生長降解特性進行了研究，以期為芐嘧磺隆污染土壤的生物修復提供理論依據和菌種資源。
1材料與方法
1.1土樣采集
采集土樣來自貴州省貴陽市花溪區常年施用野老除草劑(含芐嘧磺隆6%，乙草胺16.7%)的稻田淹水土壤(北緯N26°26′18.23″，東經E106°39′45.32″，海拔1 125.35 m)，土壤為黃壤、pH值6.0。
1.2培養基
基礎鹽培養基(minimal sodium medium，MSM)：NH4NO31.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO40.1 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌30 min。
LB培養基：酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌30 min。
固體培養基均加入2.0%瓊脂。
1.3主要試劑及儀器
主要試劑：芐嘧磺隆標品(Sigma-Aldrich，USA)，10%芐嘧磺隆原藥(安徽華星化工股份有限公司)，除乙腈和甲醇為色譜純外，其余試劑均為國產分析純；分子生物學試劑Premix rTaq購自TakaRa，Bacterial DNA Kit購自Omega；主要儀器為T100 PCR儀(Bio-Rad，USA)，Chemi Doc XRS+凝膠成像儀(Bio-Rad，USA)，Waters 600高效液相色譜系統(Waters，USA)。
引物合成及產物測序均由上海英駿生物工程有限公司完成。
1.4芐嘧磺隆降解菌的分離
稱取土壤10.0 g加入100 mL含10 mg/L芐嘧磺隆的無機鹽培養基中，于30℃恒溫振蕩培養器中150 rpm振蕩培養，每隔10 d轉接一次，逐步提高培養基中的芐嘧磺隆濃度，連續馴化、富集培養6次，直至芐嘧磺隆濃度為250 mg/L。取最后一次富集培養液適量，稀釋后涂布培養于含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM固體培養基上，30℃培養4 d左右，挑選生長良好的菌落進行分離純化并保種。
1.5芐嘧磺隆降解菌株的鑒定
1.5.1降解菌株的形態及生理生化鑒定純化的單菌落接種到LB固體培養基中活化兩次后觀察菌落形態，挑取少量單菌落涂片進行Gram染色后光學顯微鏡觀察。生理生化的鑒定依照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》進行。
1.5.2降解菌株的分子鑒定利用Bacterial DNA Kit提取細菌DNA，以降解菌DNA為模板，利用細菌16S rRNA基因擴增的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)、1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，有目的大小條帶者送出測序。測序獲得的16S r RNA基因序列使用BLAST進行同源性比較，同時聯合EzTaxon-e服務器的模式種細菌菌株比對進行分子鑒定。利用MEGA6.0中的鄰近法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹，進行1 000次自展檢驗。
1.6不同環境因素對芐嘧磺隆降解菌株生長的影響
1.6.1降解菌株的生長曲線將活化菌液分別接種于LB培養基和含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養基中，使得培養液起始OD600值為0.2左右，于30℃150 rpm振蕩培養，定時取樣測定菌體生長量。
1.6.2培養基不同pH值對降解菌株生長的影響將活化菌液接種于60 mL含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養基中，調節培養基pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，于30℃150 rpm振蕩培養，定時取樣測定OD600值。
1.6.3培養基中不同NaCl濃度對降解菌株生長的影響在含50 mg/L芐嘧磺隆的60 mL LB培養基中(原有NaCl濃度為0.5%)，分別添加NaCl使其鹽濃度分別為1.0、2.0和5.0%，接種菌液于30℃振蕩培養并測定OD600值。
1.6.4不同接種量對降解菌株生長的影響將活化的菌液調節OD600值為1.0，按1.0、5.0、7.0和10.0%的接種量分別轉接入含50 mg/L芐嘧磺隆的60 mL LB培養基中，于30℃振蕩培養并測定OD600值。
1.6.5不同裝液量對降解菌生長的影響分別取20、40和60 LB培養基(含50 mg/L芐嘧磺隆)裝入100 mL三角瓶中，接入菌液于30℃振蕩培養并測定OD600值。
1.6.6不同培養溫度對降解菌生長的影響將活化菌液轉接入60 mL LB培養基(含50 mg/L芐嘧磺隆)中，分別在26、30、34和38℃條件下振蕩培養并測定OD600值。以上每個處理均設三個重復。
1.7降解菌株在以芐嘧磺隆為唯一碳源培養基中的生長及降解
將活化菌液6000 rpm離心5 min后棄上清，菌體沉淀用MSM培養液洗滌2次后重懸。重懸菌液分別接種于含50、100和150 mg/L芐嘧磺隆的MSM培養基中，在最適生長條件下置于恒溫搖床中150 rpm振蕩培養，定時取樣測定OD600值。每個處理設三個重復。選擇菌體生長較好的培養液處理后，HPLC測定其中的芐嘧磺隆濃度并計算降解率。
培養液中芐嘧磺隆的提取及濃度測定參考李陽陽方法，簡而言之，取適量培養液加入3倍體積的二氯甲烷萃取、無水硫酸鈉吸去水分，經旋轉蒸發儀蒸干后加入色譜級甲醇溶解、過濾后利用HPLC測定培養液中的芐嘧磺隆含量。HPLC測定的色譜柱為AsilentTC-C18柱，以甲醇為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長為210 nm。
1.8數據處理
試驗數據處理采用Excel 2010和SPSS19.0軟件，多重比較采用LSD法。
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