PlcR在炭疽芽胞桿菌A16R中對(duì)其生長狀態(tài)、溶血酶活性及神經(jīng)磷脂酶活性影響（二）
2結(jié)果與分析
2.1 PlcR在炭疽芽胞桿菌的表達(dá)
2.1.1重組表達(dá)菌株構(gòu)建
表達(dá)質(zhì)粒pBE2A和測序正確的重組質(zhì)粒pBE2A-電擊轉(zhuǎn)化DH5a，用引物pBE2_F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆提取質(zhì)粒后電轉(zhuǎn)入SCS110去甲基化，用相同引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆提取質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)A16R，用相同引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pBE2A-導(dǎo)入DH5a、SCS110和炭疽芽胞桿菌中A16R中都擴(kuò)增出特異的條帶，證明重組表達(dá)載體pBE2A-已成功轉(zhuǎn)入炭疽芽胞桿菌中A16R中。
2.1.2 PlcR蛋白的表達(dá)、純化及抗PlcR多克隆抗體制備
將基因插入到表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建成重組載體pET32a-，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a和BL21后，用引物pET_F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定，都擴(kuò)增出特異明亮的條帶，表明表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入到宿主菌DH5a和BL21中。
PlcR在pET32a中表達(dá)，融合蛋白大小為51.5 kDa，pET32a-/BL21誘導(dǎo)表達(dá)，用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行蛋白印跡，結(jié)果顯示蛋白條帶大小相符，說明PlcR在BL21成功表達(dá)(圖1)。
圖1重組表達(dá)載體pET32a-plcR的構(gòu)建及PlcR蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)
2.1.3 Western blot確認(rèn)PlcR在炭疽芽胞桿菌中表達(dá)
挑取pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單菌落，LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)13 h后，取菌體1 mL進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖2A)，并使用抗PlcR多克隆抗體檢測PlcR是否在炭疽芽胞桿菌中A16R中表達(dá)。結(jié)果顯示，pBE2A-/A16R所在的泳道有一條明顯的雜交條帶，與PlcR大小相符(33.5 kDa)，因而確定PlcR在炭疽芽胞桿菌中A16R中得到表達(dá)(圖2B)。
圖2 PlcR在炭疽芽胞桿菌中A16R中表達(dá)
2.2表型分析
2.2.1生長曲線
從0時(shí)開始每隔1 h測600值最后繪制生長曲線圖(圖3)。在13 h時(shí)炭疽芽胞桿菌中A16R進(jìn)入對(duì)數(shù)末期，并且A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R 3株菌的生長曲線趨勢基本相同，差異不太明顯。
圖3生長曲線
2.2.2溶血驗(yàn)證
用蠟樣芽胞桿菌CMCC63301做陽性對(duì)照，同時(shí)選A16R做陰性對(duì)照，檢測PlcR蛋白表達(dá)對(duì)炭疽芽胞桿菌中A16R溶血能力的影響。結(jié)果顯示：37℃培養(yǎng)過夜后，蠟樣芽胞桿菌CMCC63301菌苔周圍形成明顯的溶血環(huán)，A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R均沒有明顯溶血環(huán)形成。這表明導(dǎo)入外源基因后A16R的溶血活性沒有恢復(fù)(圖4A)。
圖4重組炭疽芽胞桿菌中溶血酶活性和神經(jīng)鞘磷脂酶活性檢測
2.2.3神經(jīng)鞘磷脂酶活性驗(yàn)證
用蠟樣芽胞桿菌CMCC63301做陽性對(duì)照，同時(shí)選A16R做陰性對(duì)照，檢測PlcR蛋白表達(dá)對(duì)炭疽芽胞桿菌中A16R神經(jīng)鞘磷脂酶活性的影響，結(jié)果顯示：37℃培養(yǎng)過夜后，蠟樣芽胞桿菌CMCC63301菌苔周圍形成很大的神經(jīng)鞘磷脂酶消化環(huán)，A16R、pBE2A/A16R沒有明顯的神經(jīng)鞘磷脂酶消化環(huán)形成，pBE2A-/A16R菌落周圍有明顯的神經(jīng)鞘磷脂酶消化環(huán)形成，但沒有CMCC63301強(qiáng)。這表明導(dǎo)入外源基因后A16R的神經(jīng)鞘磷脂酶活性得到恢復(fù)(圖4B)。
3討論
在近期對(duì)炭疽芽胞桿菌PlcR研究報(bào)道中，實(shí)驗(yàn)證明導(dǎo)入外源基因能夠使炭疽芽胞桿菌中的溶血酶及神經(jīng)鞘磷脂酶的活性得到恢復(fù)。而在本研究中，在導(dǎo)入外源基因后重組菌株pBE2A/A16R恢復(fù)了神經(jīng)鞘磷脂酶活性，而溶血活性沒有恢復(fù)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果并不完全一致。我們猜測基因在炭疽芽胞桿菌中可能具有多種功能，PlcR蛋白單獨(dú)就能夠激活神經(jīng)鞘磷脂酶活性，而受基因調(diào)控的溶血素基因的激活可能需要與其他基因的共同作用。有研究稱受基因調(diào)控的毒素基因的表達(dá)還需要一個(gè)小肽PapR的作用，即PlcR的活性依賴于PapR。位于基因下游70 bp，編碼一條48個(gè)氨基酸的多肽，其功能是細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，基因的突變會(huì)影響基因的表達(dá)，導(dǎo)致溶血素的表達(dá)量大量減少，因此，我們推測溶血酶的活性的激活可能需要PlcR與PapR共同作用，但PapR對(duì)神經(jīng)鞘磷脂酶會(huì)起到什么樣的作用，仍是未知，這需要我們做更進(jìn)一步的研究。
PlcR不僅能調(diào)控其他蛋白其自身的表達(dá)也受自身所調(diào)控，且N端較為保守，屬于DNA結(jié)合區(qū)域，受PlcR調(diào)控基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在高度保守的回文序列TATGNAN4TNCATA，有報(bào)道推測它可能構(gòu)成了PlcR的識(shí)別位點(diǎn)即PlcRbox。眾所周知，炭疽芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌在遺傳學(xué)上有很高的相似性，而且對(duì)基因的進(jìn)化分析表明，蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌中的基因起源于共同的祖先，那么在炭疽芽胞桿菌中發(fā)生的無義突變是在進(jìn)化過程中自身選擇的原因造成的還是另有他因，尚不明確。本實(shí)驗(yàn)探究了外源基因?qū)μ烤已堪麠U菌的功能影響，另一方面，將炭疽芽胞桿菌中突變的基因重新突變回正常基因，進(jìn)而研究其對(duì)炭疽芽胞桿菌中功能的影響同樣是我們值得考慮的。
因此，我們將構(gòu)建PlcRpapR融合蛋白及恢復(fù)炭疽芽胞桿菌中突變的基因的功能，來進(jìn)一步研究PlcR在A16R中的功能。