維氏氣單胞菌分離與純化、一步生長曲線、熱穩定性及pH穩定性研究（二）
2結果
2.1噬菌體分離與純化
從發病鯽魚腸道中獲得的分離液經雙平板法后在平板上可見有大量噬菌斑產生，圖1A可見噬菌斑呈圓形，中間透明，邊緣清晰整齊，無暈環，但大小不一，分布不均勻，直徑在0.2～1.1 mm，噬菌斑的存在說明腸道分離液中有宿主菌的噬菌體存在。噬菌體經純化增殖后，梯度稀釋，用雙層平板法計數，該噬菌體的效價可達3.0×1012PFU/mL，噬菌體命名為SJTJYCA01。
圖1噬菌體的噬菌斑(A)和超微形態圖(B)
2.2噬菌體的超顯微形態
通過電子顯微鏡觀察發現，本試驗分離的噬菌體為有尾噬菌體，屬于尾病毒目短尾噬菌體科，頭部直徑在45～60 nm，尾部長在16～26 nm，見圖1B。
2.3最適感染復數
噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的MOI為0.1時的效價最高(效價值達2.55×109)，說明噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的最適感染復數為0.1。見表1。
表1噬菌體SJTJYCA01的最適感染復數
2.4一步生長曲線
一步生長曲線的結果見圖2，噬菌體SJTJYCA01的潛伏期為20 min，裂解期達40 min，裂解量為裂解期平均噬菌體數(14 458 PFU/mL)/潛伏期平均噬菌體數(255 PFU/mL)=57。
2.5熱穩定性
在40℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率不隨時間的增加而減少；在60℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率大幅下降，作用20 min后存活率僅為原噬菌體的3%；在80℃條件下，各個時間段均未見有噬菌體存活。見圖3。
圖2噬菌體的一步生長曲線
圖3噬菌體SJTJYCA01的熱穩定性
2.6 pH穩定性
噬菌體SJTJYCA01對強酸強堿均較為敏感，在pH 5～10時較為穩定；噬菌體SJTJYCA01的最適pH 7。見圖4。
圖4噬菌體SJTJYCA01的pH穩定性
3討論
近年來，國內外有關維氏氣單胞菌病例的報道逐年增多，其流行呈明顯上升趨勢，并已成為一種危害嚴重的人—獸—魚共患病原菌。噬菌體作為一種新興的生物抑菌劑日漸受到學者們的關注。目前，國內外關于維氏氣單胞菌噬菌體的研究鮮有報道，僅可見Taruna等從池水中分離到維氏氣單胞菌的噬菌體VTCCBPA5和呂孫建等從中華鱉養殖塘中分離得到的非特異性寬譜噬菌體NTHP01(以嗜水氣單胞菌為宿主分離獲得)。
本試驗以鯽魚源維氏氣單胞菌為宿主菌，從發病鯽魚的腸道中分離獲得噬菌體SJTJYCA01。該噬菌體在宿主菌上可形成圓形、透亮，具有典型烈性噬菌體特征的噬菌斑；參照《病毒分類——國際病毒分類委員會第九次報告》，對噬菌體SJTJYCA01的形態進行觀察分析，結果可判定該噬菌體為尾病毒目短尾噬菌體科噬菌體(頭徑45～60 nm，尾長16～26 nm)，此與Taruna等分離獲得的VTCCBPA5同屬于短尾噬菌體科(頭徑56 nm，尾長5 nm)，卻有別于呂孫建等分離獲得的肌尾噬菌體科噬菌體NTHP01(頭徑60～145 nm，尾長80～455 nm)。因此，這是鯽魚源維氏氣單胞菌短尾科烈性噬菌體在中國的首次報道。
感染復數是研究噬菌體與宿主之間量化與產出的重要生物學指標，在不同感染復數條件下，噬菌體感染宿主菌后分裂得到的噬菌體子代的數量不同，因此，確定最適感染復數對于噬菌體進一步的應用研究具有重要作用。本試驗獲得噬菌體SJTJYCA01的最適感染復數為0.1，與王志麗分離的鱉源氣單胞菌噬菌體的最適感染復數相同，說明該噬菌體裂解效率較高，少量的噬菌體侵染宿主菌即可產生噬菌體子代；噬菌體感染宿主菌的潛伏期和裂解期的長短及裂解量的大小通常與噬菌體、宿主菌及生長條件有關，從潛伏期可得知噬菌體吸附于細胞并釋放出子代噬菌體的最短時間，潛伏期和裂解量則是噬菌體增殖的2個特征性指標。噬菌體SJTJYCA01潛伏期和裂解期分別為20 min、40 min，較噬菌體VTCCBPA5(潛伏期35 min)、泥鰍源氣單胞菌的噬菌體pAh1(潛伏期30 min)和鱉源氣單胞菌的噬菌體(潛伏期50 min)要短，遠小于噬菌體NTHP01(潛伏期150 min)，且同樣對宿主菌具有較高的裂解量。
目前，氣單胞菌屬細菌(包括維氏氣單胞菌)能造成多種水生動物發生運動性氣單胞菌敗血癥，該病在浙江、湖南、湖北、江西等地的發病高峰期為每年的6～9月(養殖水溫在20～30℃，pH一般呈弱堿或弱酸性)，常常出現急性暴發病，嚴重時的死亡率可達90%以上。本試驗分離獲得的噬菌體SJTJYCA01在溫度低于40℃時能保持較好的穩定性和活性，并在pH 7附近最為穩定。因此，噬菌體SJTJYCA01能很好的適應水產養殖環境，在水生動物細菌性疾病防控中應用具有極大的可能性。本試驗篩選獲得的維氏氣單胞菌烈性噬菌體，不僅豐富了水產致病菌噬菌體的菌種資源，并將為噬菌體作為生物抑菌劑的開發應用提供科學依據。
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