泥蚶致病性哈維氏弧菌的分離與鑒定、藥敏實驗結果
弧菌是海洋環(huán)境中常見的細菌種群之一，廣泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動物體內(nèi)。弧菌屬種類繁多，主要致病弧菌有哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、霍亂弧菌(V.cholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等。哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖業(yè)重要的條件致病菌，已有研究表明，哈維氏弧菌可感染褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、尖吻鱸(Latescalcarifer)、刺尾魚(Acanthurussohal)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)和文蛤(Meretrixmeretrix)等重要水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，并致其死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。
泥蚶(Tegillarcagranosa)屬瓣鰓綱、列齒目、蚶科、泥蚶屬，是我國沿海灘涂的主要養(yǎng)殖貝類之一，也是沿海居民青睞的生食雙殼貝類之一。隨著泥蚶養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，在每年溫度上升的4—5月和繁殖后的7—8月間，易發(fā)生泥蚶細菌性疾病，嚴重影響了泥蚶養(yǎng)殖效益和泥蚶養(yǎng)殖業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，夏季泥蚶體內(nèi)的優(yōu)勢菌群主要是弧菌屬細菌和氣單胞菌屬細菌；對浙江省11市泥蚶副溶血弧菌污染情況檢測發(fā)現(xiàn)，50%為陽性。尚未見有關哈維氏弧菌感染泥蚶的報道，僅見泥蚶血紅蛋白(Tg-HbⅡ)酶解多肽對哈維氏弧菌具有明顯的抗菌活性的研究。2014年8月，浙江灘涂養(yǎng)殖泥蚶暴發(fā)大規(guī)模死亡，其主要特征為閉殼肌無力，軟體部顏色發(fā)白，體液呈淡紅色或無色，黏液增多。筆者自瀕死的泥蚶中分離得到1株優(yōu)勢菌，從該菌株的形態(tài)、生理生化特征、分子生物學分類方面進行研究，以期為泥蚶病害研究提供生物學資料，為泥蚶弧菌病的防治提供科學依據(jù)。
菌株J14的分離與鑒定
哈維氏弧菌為條件致病菌，有毒株可引起養(yǎng)殖貝類發(fā)病、死亡。如感染哈維氏弧菌的文蛤，在發(fā)病高峰期病狀特征明顯，解剖患病文蛤發(fā)現(xiàn)，其外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力、兩殼呈張開狀態(tài)，軟體部消瘦，部分發(fā)病文蛤的鰓黏液明顯增多。本試驗中，菌株J14是從夏季規(guī)模性死亡的泥蚶中分離得到的，表明菌株J14可在高溫環(huán)境下生長。由人工感染試驗結果可知，感染后的泥蚶出現(xiàn)明顯的病癥：外套膜萎縮，閉殼肌松弛，開合無力，軟體部消瘦，有些發(fā)爛發(fā)白，肝胰腺顏色淡紅，體液淡紅至無色，部分患病泥蚶鰓黏液明顯增多，黏液呈煙灰色。感染后死亡率高達90%。人工感染發(fā)病泥蚶的癥狀與自然發(fā)病的泥蚶癥狀表現(xiàn)一致，說明菌株J14具備重復感染的能力。泥蚶貝殼堅硬，如受到外界刺激，則雙殼緊閉，較難通過注射方法將菌液注射到泥蚶軟體部，因此本試驗中采用不同密度的J14菌液浸泡感染泥蚶，分析得到菌株J14感染泥蚶的96 h半致死密度為7.74×106個/mL，表明菌株J14具有較強致病性。
對菌株J14和J19進行形態(tài)、常規(guī)生理生化鑒定，結果顯示，2個菌株均為革蘭氏陰性細菌，硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上呈黃色，生理生化鑒定結果與哈維氏弧菌特征極為相近。與標準菌株比較，部分鑒定項存在差異，推測2個菌株可能為哈維氏弧菌。對菌株J14和J19進行16S rRNA基因分子生物學鑒定，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，2株菌與哈維氏弧菌聚為一支。綜合生理生化與分子生物學鑒定結果，確定這2個菌株均為哈維氏弧菌。
哈維氏弧菌J14的毒力基因
已有研究表明，弧菌屬不同種間存在相同的毒力基因，相同的種內(nèi)存在不同的毒力基因，毒力基因或相關毒力因子的轉移是導致某些無毒株變?yōu)橛卸局暌约俺霈F(xiàn)弧菌新病原的重要原因。本試驗中，共檢測了14種毒力基因的攜帶情況，結果顯示，哈維氏弧菌J14和J19均攜帶有群體效應調(diào)控基因luxR，毒力調(diào)控基因toxR，溶血素基因vhhA、vhhB，毒力相關基因toxS，幾丁質(zhì)酶基因chiA，絲氨酸蛋白酶基因。Xu等對46株不同哈維氏弧菌的17種毒力基因進行PCR分析，發(fā)現(xiàn)所有的致病菌均含有l(wèi)uxR、toxRVh、vhh、chiA、絲氨酸蛋白酶基因這5種毒力基因，表明哈維氏弧菌毒力是由多基因共同作用的結果。據(jù)Nakamura等報道，毒力基因在適應不同環(huán)境和不同宿主方面具有優(yōu)勢，擁有很強的轉移能力。另外，哈維氏弧菌致病菌株較非致病菌株可能擁有更強的接收通過基因水平轉移而來的外源基因的能力。本試驗中的鞭毛結構基因flaA在2個菌株中存在差異，J14不含有flaA基因，而J19含有flaA基因，由此推測，毒力基因水平轉移可能是2株菌攜帶毒力基因差異的原因。
哈維氏弧菌J14的藥敏性
藥物的敏感試驗結果表明，2個菌株對青霉素、氨芐西林、阿莫西林和桿菌肽不敏感。文蛤源哈維氏弧菌對氨芐西林和阿莫西林不敏感；珍珠龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)源哈維氏弧菌X12XC30對呋喃唑酮、阿莫西林和紅霉素耐藥，X13SZ03對四環(huán)素、呋喃唑酮、利福平、復方新諾明和頭孢克肟等耐藥。有研究顯示，不同年份、不同來源、不同養(yǎng)殖環(huán)境分離得到的哈維氏弧菌對抗生素的耐藥存在差異，環(huán)境、宿主影響細菌的耐藥性，同時抗生素的過度使用導致細菌產(chǎn)生更廣的耐藥性。本試驗中的2株哈維氏弧菌對26種藥物敏感，其中氯霉素、呋喃唑酮、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢拉啶、諾氟沙星、氧氟沙星屬于水生食品動物禁用藥，因此在泥蚶弧菌病的防治過程中應合理合規(guī)用藥，通過改善泥蚶養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)和底質(zhì)，以達到生態(tài)防治的目的。
結論
從浙江灘涂發(fā)病泥蚶中分離得到優(yōu)勢菌株J14，經(jīng)生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析，確定為哈維氏弧菌，該菌株具有較強的致病性，攜帶7種毒力基因，對慶大霉素、卡那霉素、復方新諾明等26種常用抗生素藥物敏感。
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