優化培養基配方減少無機硒對粗毛纖孔菌的抑制作用，同時提高富硒菌絲的產量（三）
2.2響應面法優化粗毛纖孔菌菌絲富硒培養基配方
2.2.1響應面試驗結果及方差分析通過Design-Expert 8.06軟件設計響應面試驗,基于單因素結果,以麩皮(X1)、葡萄糖(X2)及硒(X3)為自變量,以粗毛纖孔菌菌絲生長速率平均值為響應值(Y),進行響應面試驗,試驗方案與結果見表2。通過Design-Expert 8.06對表2結果進行分析,得到的3因素與菌絲生長速度(Y)之間的回歸模型可以表述為:
表2 BBD實驗設計及結果
2.2.2各因素交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的響應面分析為考慮交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響,在另一因素條件固定不變(編碼水平為零)的情況下,分析兩兩因素交互作用對其菌絲生長速度的影響。通過Design-Expert 8.06軟件處理上述實驗設計得到3D響應曲面圖和等高線分析圖(圖5),可以直觀地看出各個因子之間的交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響。響應面分析中,等高線的形狀可以反映兩因素間交互作應對響應值影響的強弱大小,圓形表示不顯著,橢圓形則與之相反;等高線的稀疏情況反映響應面圖像的平陡情況。從圖5可以看出,兩兩因素之間的等高線形狀均為橢圓形,表明其交互作用顯著。由圖5A可知,粗毛纖孔菌菌絲生長速度(Y)隨麩皮添加量(X1)和葡萄糖添加量(X2)的增加而增加;由圖5B可見,粗毛纖孔菌菌絲生長速度(Y)隨麩皮添加量(X1)的增加和硒添加量(X3)的減小而增加;在較小硒添加(X3)情況下,麩皮添加量(X1)
表3菌絲生長速度響應模型的方差分析
圖5兩兩因素交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度影響的響應曲面圖和等高線分析圖
在很大的范圍內均可取到較大的Y值;圖5C也表現出與圖5B相同的趨勢,表明硒添加對粗毛纖孔菌菌絲生長不利,但可以通過其他因素與其交互作用減少其對粗毛纖孔菌菌絲生長抑制作用的影響。綜合各圖,各因素之間的交互作用與回歸模型的方差分析結果相吻合。由Design-Expert 8.06軟件分析得到最大響應值(Y)時最優培養基配方為:麩皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,此時富硒粗毛纖孔菌菌絲生長速度預測值為8.19 mm/d。
2.3驗證實驗
為了檢測響應面結果的準確性,以改良PDA培養基為陰性對照,以等量硒添加改良PDA培養基為陽性對照,配制上述最優培養基配方進行富硒粗毛纖孔菌菌絲培養實驗,每組八個重復,測得粗毛纖孔菌及富硒粗毛纖孔菌菌絲生長速度見圖6。響應面優化培養基實測值8.41 mm/d>預測值8.19 mm/d>改良PDA實測值6.79 mm/d>等量硒添加改良PDA實測值 4.28 mm/d,且優化后的富硒培養基培養的粗毛纖孔菌菌絲的稠密度更高(圖6)。與等量硒添加改良PDA相比,以響應面優化培養基進行培養,粗毛纖孔菌菌絲生長速度提高了0.965倍。此外,通過電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)對最優培養基培養菌絲的硒富集量進行檢測,測得富硒粗毛纖孔菌菌絲硒富集量為31.584μg/g。說明采用響應面法獲得的模型能較好地預測富硒粗毛纖孔菌菌絲的生長情況,該富硒培養基配方可以減少外源硒對粗毛纖孔菌菌絲抑制作用的影響,使其能夠在富硒的同時正常甚至更好地生長,提高富硒菌絲的產量,具有一定的實用價值。
圖6驗證實驗結果
3結論
首次針對粗毛纖孔菌對無機硒的耐受度進行探索,發現該菌菌絲的生長情況受外源硒影響較大,當硒濃度達到或大于37.25 mg/L時,該菌菌絲生長受到顯著的抑制作用(P<0.05)。因此,本研究通過響應面法對該菌富硒培養基成分進行優化,旨在保證該菌菌絲在正常生長情況下合理富集、積累并轉化無機硒為有機硒,提高富硒粗毛纖孔菌菌絲的產量。
經響應面法優化得到富硒粗毛纖孔菌菌絲生長最優培養基配方為:麩皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L。其中葡萄糖添加量、麩皮添加量和硒添加量對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長均具有極顯著作用;且麩皮與葡萄糖、麩皮與硒添加、葡萄糖與硒添加之間的兩兩交互作用對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長均具有顯著作用(P<0.01)。在此條件下,富硒粗毛纖孔菌實際菌絲生長速度達到8.41 mm/d,與預測值相符,且硒富集量達到31.584μg/g。說明采用響應面法優化獲得的富硒粗毛纖孔菌菌絲生長培養基配方具有一定的實用價值。
該配方通過培養基內因素間的交互作用減少了外源硒對粗毛纖孔菌菌絲生長抑制作用的影響,確定了合理的硒添加比例,與等量硒添加改良PDA相比,優化后粗毛纖孔菌菌絲生長速度提高了約1倍(0.965倍);與同配方無硒添加培養基相比,菌絲硒含量增加為31.584μg/g。國際營養聯合會規定缺硒人群每人每天食用硒量不少于50μg,每人每天食用本研究富硒粗毛纖孔菌制品1.58 g即可完全滿足此要求。本研究在硒抑制與菌絲生長之間找到平衡點,獲得了最優配方,為富硒粗毛纖孔菌菌絲體的大量制備、富硒粗毛纖孔菌子實體的栽培及其它后續研究提供了理論依據。
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