耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定及對(duì)線蟲(chóng)毒力作用（一）
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是自然界中常見(jiàn)的革蘭氏陰性腸桿菌，主要分布于人體內(nèi)胃腸道和鼻咽部的正常寄居菌群。當(dāng)其生態(tài)位發(fā)生改變或者人體免疫力降低時(shí)，可引起肺炎、下尿路感染、菌血癥等嚴(yán)重的感染性疾病，是社區(qū)和院內(nèi)感染最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌之一;尤其對(duì)于ICU患者、有手術(shù)治療史及接受氣管插管等創(chuàng)傷性操作史的患者，肺炎克雷伯菌感染將帶來(lái)致命性的后果。然而，隨著抗生素的不合理使用，肺炎克雷伯菌對(duì)多種抗生素的耐藥性正逐年增加，2017年曾倩倩等的回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢吡肟、阿米卡星、頭霉素等各類常用抗生素的耐藥率也呈不同程度上升，使得碳青霉烯類抗生素成為了對(duì)抗肺炎克雷伯菌的最后一道防線。
近十年來(lái)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)的檢出率呈逐年上升趨勢(shì)。這將給臨床感染的治療及控制帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。有研究報(bào)導(dǎo)，我國(guó)目前流行的CRKP主要為CG258(Clonal group)克隆的ST11型菌株，占我國(guó)CRKP的60%。CRKP的耐藥性主要通過(guò)菌體產(chǎn)生碳青霉烯酶水解抗生素所賦予，碳青霉烯酶基因通常由CRKP的大型耐藥質(zhì)粒攜帶，常見(jiàn)的類型包括blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM及blaIMP等。Bedhomme等研究表明大型耐藥質(zhì)粒的攜帶會(huì)帶來(lái)差異適應(yīng)性。
由于質(zhì)粒的運(yùn)輸成本，所以會(huì)造成宿主菌適應(yīng)性的降低，除此之外適應(yīng)性還與攜帶耐藥基因的質(zhì)粒拷貝數(shù)相關(guān)。Newbury等研究也證實(shí)了細(xì)菌長(zhǎng)期暴露于抗生素環(huán)境中可能會(huì)增加質(zhì)粒-宿主之間的連接性，其所攜帶的多個(gè)質(zhì)粒之間會(huì)存在互利或拮抗的相互作用。雖然攜帶耐藥基因的大型質(zhì)粒能為宿主菌帶來(lái)抗生素耐藥性，但如此大型的質(zhì)粒對(duì)宿主菌更廣泛的適應(yīng)性效應(yīng)及毒力影響尚不明確。本研究主要通過(guò)探究攜帶不同耐藥基因的質(zhì)粒以及攜帶單個(gè)或多個(gè)耐藥基因的質(zhì)粒對(duì)CRKP環(huán)境適應(yīng)性及毒力作用的影響，以期對(duì)臨床CRKP的感染控制與治療提供重要的理論依據(jù)和用藥指導(dǎo)。
1材料與方法
1.1材料
①細(xì)菌及線蟲(chóng):收集2011年～2015年昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院CRKP臨床分離株共10株。N2野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans，C.elegans)、大腸桿菌E.coli OP50、肺炎克雷伯菌質(zhì)控菌株ATCC10031、肺炎克雷伯菌ATCC700603均購(gòu)自American Type Culture Collection，ATCC(https://www.atcc.org/)。②培養(yǎng)基:NGM線蟲(chóng)培養(yǎng)基配方(1L):NaCl 3 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂17 g，膽固醇(5 mg/mL，無(wú)水乙醇配置，過(guò)濾除菌)1 mL，高壓滅菌后加入過(guò)濾除菌的1 M CaCl21 mL，1 M MgSO41 mL，1 M磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)10 mL倒入平板，過(guò)夜晾干后加適量E.coli OP50單克隆菌液制成NGM發(fā)育板上，加適量CRKP分離株的單克隆菌液制成NGM檢測(cè)板備用;LB液體及固體培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置。③主要試劑及緩沖液:M9緩沖液(1 L):七水磷酸氫二鈉5.8 g，磷酸二氫鈉3.0 g，氯化鈉5.0 g，七水硫酸鎂0.25 g，添加ddH2O至1 L，高壓蒸汽滅菌備用;線蟲(chóng)Bleach裂解液(100 mL體系):5 M NaOH 10 mL，次氯酸鈉20 mL(5%有效氯含量)，ddH2O 70 mL，4℃避光儲(chǔ)存?zhèn)溆?1 M磷酸鹽緩沖液(pH=6.0):KH2PO4117.3 g，K2HPO424.0 g，添加ddH2O至1 L，高壓滅菌備用;線蟲(chóng)凍存液(1 L):NaCl 5.85 g，KH2PO46.80 g，甘油300 mL，1 M NaOH 5.60 mL，滅菌后加入0.3 mL無(wú)菌1M MgSO4備用。
1.2細(xì)菌耐藥基因型鑒定
根據(jù)檢驗(yàn)科VITEK平臺(tái)的藥敏及菌種鑒定結(jié)果，收集昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院CRKP臨床分離株10株，根據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)規(guī)程》對(duì)菌株進(jìn)行分離、純化、保菌備用。采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，利用PCR技術(shù)對(duì)碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、blaLAP進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，隨后對(duì)陽(yáng)性條帶進(jìn)行測(cè)序、Blastn比對(duì)分析。肺炎克雷伯菌ATCC10031、ATCC700603作為對(duì)照菌株。見(jiàn)表1。
表1各耐藥基因PCR引物
1.3菌種鑒定及MLST分型
擴(kuò)增16S rRNA基因，sanger雙向測(cè)序后進(jìn)行Blastn比對(duì)分析，鑒定菌種;PCR擴(kuò)增七個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)，sanger雙向測(cè)序后通過(guò)等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定其ST類型(http://bigsdb.web.pasteur.fr/)。
1.4細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定
分離純化后的菌株從-80℃取出，接種于5 mL未添加亞胺培南抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200 rpm，37℃搖菌復(fù)蘇培養(yǎng)4 h。將復(fù)蘇后的細(xì)菌在無(wú)抗性LB平板上劃線過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落在5 mL無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)8～12 h，待細(xì)菌進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，用無(wú)菌PBS稀釋菌液至OD600=0.1(MCF=0.13～0.14)，取稀釋后的菌液50μL接種至加有5 mL LB液體培養(yǎng)基的濁度瓶中，加入亞胺培南抗生素，濃度分別為:0、2和8 mg/mL，200 rpm，37℃搖菌培養(yǎng)。測(cè)定濁度瓶初始MCF值，之后每隔30 min測(cè)定一次MCF值，連續(xù)測(cè)定24 h。每個(gè)分離株的各抗生素濃度組平行培養(yǎng)2瓶，整體實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制生長(zhǎng)曲線，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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