耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌生長曲線測定及對線蟲毒力作用（二）
1.5線蟲侵染實驗
1.5.1線蟲復蘇及同步化取凍存的線蟲室溫融化，用10 mL M9緩沖液洗滌，靜置后棄上清液。將線蟲沉淀加入到含有E.coli OP50的NGM發育板上，20℃培養2～3 d，期間顯微鏡下觀察線蟲發育情況、密度及產卵情況，直到平板上有大量蟲卵或者線蟲體內有大量蟲卵。用3 mL M9緩沖液將線蟲及蟲卵從平板上沖洗下來，得到的混懸液裝到15 mL離心管，離心棄上清。用5 mL M9緩沖液洗滌、離心、棄上清，盡量將細菌洗凈，剩余沉淀即為線蟲和蟲卵。加入2倍體積的線蟲裂解液，劇烈漩渦震蕩5 min直至液體變得清亮，離心棄上清。此時剩下的沉淀為蟲卵，加入10 mL M9緩沖液重懸蟲卵，離心棄上清，重復兩次，以去除殘余的線蟲裂解液。再加入1 mL M9緩沖液重懸蟲卵，吸取1～2μL蟲卵液至載玻片上推開，在顯微鏡下觀察蟲卵數量及裂解效果，將重懸后的蟲卵傾斜放置于20℃培養箱孵化，16 h后得到同步化的線蟲幼蟲。將線蟲幼蟲加入NGM發育板中，20℃培養45～54 h得到同步化的線蟲成蟲。
1.5.2線蟲侵染
在NGM培養基中加入0.2 mmol/L的氟尿苷(Floxuridine，FUDR)以抑制線蟲繁殖，倒板，取過夜培養的單克隆菌液用M9緩沖液稀釋25倍后鋪至無抗生素的NGM平板，配置成NGM檢測板，對照組采用肺炎克雷伯菌ATCC10031和ATCC700603菌株配置。將同步化的線蟲成蟲用M9緩沖液從發育板上洗脫下來，離心棄上清，加入適量M9緩沖液重懸，取適量重懸后的線蟲加到NGM檢測板及NGM對照板上，在體式解剖鏡下計數線蟲數量，控制每個平板線蟲數為(50±5)條，每個分離株做兩個平行檢測板，整體實驗重復兩次。
1.5.3繪制線蟲生存曲線
每天同一時間段在顯微鏡下觀察線蟲的存活情況，記錄每日死亡數量，線蟲死亡的判定標準:蟲體僵直，腫脹破裂，輕輕敲打平板線蟲仍不能運動。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制線蟲生存曲線，Log-rank檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析，P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1細菌耐藥基因型鑒定10個分離株耐藥基因鑒定結果見圖1、表2。
圖1耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因型電泳圖
表2耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因型鑒定及MLST序列分型
2.2細菌菌種鑒定及ST分型
通過對10個分離株進行16S rRNA基因驗證，對sanger測序結果進行Blastn比對，確認10個分離株均為肺炎克雷伯菌;對七個管家基因PCR擴增后測序，MLST等位基因比對后，得到5種ST類型，其中ST-11型和ST-290型各三株、ST-395型兩株、ST-340型和ST-437型各一株。見表2。
2.3菌株生長曲線
根據碳青霉烯類耐藥基因鑒定結果，對分離株進行分組(表3)，繪制生長曲線。在沒有抗生素壓力下，各組菌株生長趨勢基本一致，在2～5 h處于指數生長期，細菌生長迅速;第5～24 h生長曲線趨于穩定，處于平臺期，體系MCF值趨于穩定，各組生長曲線差異無統計學意義(P>0.05)(圖2A)。在2 mg/mL亞胺培南壓力下，對照組全程未見生長，所有分離株均在4 h后才開始進入指數生長期，6 h后進入平臺期(圖2B)，攜帶單個耐藥基因組中blaIMP組細菌總量最低，其次為blaKPC組;攜帶雙耐藥基因組中blaKPC+blaNDM組、blaIMP+blaOXA組細菌總量最高。采用Kruskal-Wallis檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析發現，除blaNDM組、blaOXA組與blaNDM+blaOXA組比較沒有差異，攜帶單個耐藥基因與攜帶雙耐藥基因對細菌的生長適應性和細菌總量有不同的影響，差異均有統計學意義(P<0.001)(圖3)。在8 mg/mL亞胺培南壓力下，對照組全程未見生長，其余各組菌株表現出不同程度的適應性差異(圖2C)。其中blaKPC組、blaKPC+blaNDM組最快進入指數生長期(4～6 h)，其次為blaNDM組，blaOXA組在第14 h才開始生長，15～17 h處于對數期;blaKPC組在從16 h開始曲線出現下降趨勢進入衰亡期。細菌總量以blaKPC+blaNDM組最高，blaIMP+blaOXA組最低。采用Kruskal-Wallis檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析發現，單耐藥基因組中blaNDM組和blaIMP組適應性強于blaOXA組，差異具有統計學意義(P<0.001);雙耐藥基因組中blaKPC+blaNDM組和blaNDM+blaOXA組分別比單耐藥基因組blaKPC和blaOXA生長適應性強，差異具有統計學意義(P<0.001)，見圖4。
表3根據菌株攜帶的碳青霉烯類耐藥基因分組
圖2不同抗生素濃度下各菌株的生長曲線
圖3 2 mg/mL亞胺培南培養基中各組細菌總量的兩兩比較
圖4 8 mg/mL亞胺培南培養基中各組細菌總量的兩兩比較