辣木籽提取物制備、對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制作用及在在液態(tài)乳中的應(yīng)用（一）
辣木（Moringaoleifera），辣木科辣木屬植物，具有豐富的藥用和食用價(jià)值，廣泛種植于我國(guó)的云南、廣東、廣西、四川等地，以及印度、非洲、巴基斯坦等國(guó)家。辣木籽富含蛋白質(zhì)、油脂、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)含有黃酮、多酚、多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、降血糖血脂、治療糖尿病、護(hù)肝、抗癌等功能活性。辣木籽提取物是一種植物源天然抑菌劑，對(duì)念珠球菌、大腸桿菌、銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等不同真菌和細(xì)菌有抑制作用，其抑菌成分被認(rèn)為主要是酚類(lèi)、黃酮類(lèi)物質(zhì)。
蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus,B.cereus）是污染乳及乳制品主要的有害微生物之一，屬重點(diǎn)防控生物性危害因子，不僅會(huì)引起胃病、嘔吐、腹瀉，還能通過(guò)分泌蛋白酶降低乳制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，縮短產(chǎn)品的貨架期。Zhao等從中國(guó)5個(gè)省份的500份乳制品樣品中分離出54株蠟樣芽孢桿菌，包括嬰幼兒配方奶粉（14%）、原料奶（26%）、巴氏殺菌奶（24%）、超高溫奶（16%）和奶酪（20%）。另外，巴氏殺菌對(duì)孢子的殺滅率低，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌仍存在于市售巴氏乳中，其毒力基因?qū)θ梭w健康存在威脅。目前，加熱殺菌是保障乳品安全的主要技術(shù)手段，但過(guò)度加熱會(huì)破壞乳中熱敏性營(yíng)養(yǎng)成分，因此在溫和殺菌方式下，利用天然抑菌成分延長(zhǎng)乳品保質(zhì)期是乳品加工新技術(shù)的重點(diǎn)。已有研究表明，大蒜精油和乳酸鏈球菌素對(duì)乳中蠟樣芽孢桿菌有抑制作用，但天然抑菌劑應(yīng)用于乳及乳制品中的具體抑菌效果仍需要進(jìn)一步探究。
本研究以辣木籽為原料，采用超聲輔助提取法制備辣木籽提取物，以蠟樣芽孢桿菌為指示菌，通過(guò)響應(yīng)面法，以抑菌圈大小為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)辣木籽提取物的抑菌活性，明確溫度、pH值和紫外線照射對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響，并研究辣木籽提取物在全脂乳和脫脂乳中的實(shí)際抑菌效果，以及對(duì)液態(tài)乳色度、風(fēng)味、黏度的影響，為辣木籽提取物在液態(tài)乳中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
辣木籽購(gòu)自云南帥潤(rùn)科技有限公司；三株芽孢桿菌屬新型ST分離株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，B.cereus）ST-1351、ST-1350、ST-1349由乳品加工質(zhì)量安全工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離自市售羊乳及其生產(chǎn)線；全脂乳粉、脫脂乳粉恒天然集團(tuán)安佳；營(yíng)養(yǎng)肉湯、瓊脂索萊寶試劑公司；無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯所有分離用的有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
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1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1菌懸液制備
將凍存在?80℃的蠟樣芽孢桿菌采用劃線法在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基活化2次，挑單菌落接種于5 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)20 h，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。培養(yǎng)后的菌懸液經(jīng)離心（8500×g，10 min）去除上清液，使用生理鹽水洗滌菌體3次，隨后使用一定量的生理鹽水懸浮菌體沉淀，測(cè)定并調(diào)整菌懸液的OD600nm=0.5，使菌懸液濃度約為108CFU/mL。
1.2.2辣木籽提取物制備及單因素實(shí)驗(yàn)
將辣木籽去殼粉碎過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱取辣木籽粉末1.00 g，用冰乙酸和氨水調(diào)節(jié)pH至5，加入50 mL蒸餾水超聲15 min后，30℃條件下浸提2 h，在此基礎(chǔ)上設(shè)置單因素實(shí)驗(yàn)，考察不同提取條件對(duì)辣木籽抑菌活性的影響，以抑菌圈為指標(biāo)，分別考察提取溶劑（蒸餾水、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、石油醚）、pH（2、3、4、5、6、7）、料液比（1:10、1:30、1:50、1:70、1:90、1:110 g/mL）、浸提溫度（10、20、30、40、50、60℃）、浸提時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）5個(gè)因素對(duì)辣木籽抑菌活性成分制備的影響。提取液過(guò)濾后于40℃旋蒸至恒重，復(fù)溶并定容至濃度為0.1 g/mL。
1.2.3抑菌圈的測(cè)定
根據(jù)石超的方法稍作修改，量取15 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后備用。將制備好的菌懸液用生理鹽水稀釋至107CFU/mL，取100μL菌懸液均勻涂布至培養(yǎng)基上，將牛津杯（外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm、高10 mm）至于培養(yǎng)基上，調(diào)整牛津杯位置并輕輕按壓，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置3只牛津杯。向牛津杯中加入經(jīng)0.22μm無(wú)菌濾器過(guò)濾后的100μL辣木籽提取物。以1 mg/mL青霉素G鈉為陽(yáng)性對(duì)照，37℃培養(yǎng)20 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。
1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ST-1349菌株對(duì)辣木籽提取物抗性較強(qiáng)，為達(dá)到最好抑菌效果，故選取ST-1349菌株為試驗(yàn)菌株，以蒸餾水為提取溶劑，對(duì)pH、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間四個(gè)主要影響因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)(表1)，以抑菌圈大小為響應(yīng)值，利用Box-Behnken Design進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化辣木籽抑菌成分提取的工藝條件，從而得到最佳提取工藝。
表1響應(yīng)面因素水平編碼表
1.2.5最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定
最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）的測(cè)定參照Kang等的方法，將營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基冷卻至50℃左右后，加入24孔板，并添加辣木籽提取物使其濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 mg/mL。接種2μL濃度為108CFU/mL的菌懸液于24孔板，以1 mg/mL的青霉素G鈉為陽(yáng)性對(duì)照，將樣品于37℃培養(yǎng)，MIC和MBC分別為24 h和48 h后蠟樣芽胞桿菌不生長(zhǎng)的辣木籽提取物濃度。
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