不同pH磷酸鹽緩沖液中藥物視頻顯微溶出測(cè)度
越來越多的制藥工業(yè)管線中的候選藥物表現(xiàn)出較差的水溶性，大多數(shù)已上市的口服速釋制劑幾乎不溶解。這些藥物通常生物利用度低且不一致，在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中被歸類為II類和IV類（低溶解度）藥物。為了對(duì)新化學(xué)實(shí)體(NCE)進(jìn)行分類和表征，需要有效的溶解速率早期篩選方法，該方法可以使用少量材料進(jìn)行。在過去幾年中，人們對(duì)早期NCE開發(fā)中的高通量方法（可以同時(shí)評(píng)估多個(gè)條件和樣品）的興趣急劇增加。由于實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在可以以最少的材料要求篩選大型化學(xué)和配方空間。制藥行業(yè)在高通量實(shí)驗(yàn)的實(shí)施和開發(fā)研究制劑前條件的系統(tǒng)方法方面投入了大量資金。使用原位成像技術(shù)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶解過程以及與起始材料不同形態(tài)的其他不溶性沉淀物的形成。該技術(shù)還可以更好地理解藥物顆粒在溶液中的行為，而不是通過單獨(dú)評(píng)估顆粒大小和形態(tài)進(jìn)行批量測(cè)量。研究在非常小的樣品體積中溶解的方法可能是視頻顯微鏡設(shè)置，例如oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（BioSense）。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和紫外吸收行為知識(shí)的需求被溶解顆粒顯微照片的圖像分析所取代，因?yàn)闇y(cè)量的是觀察到的二維(2D)顆粒面積的減少而不是特定的藥物濃度。這種視頻顯微裝置能夠獲取藥物顆粒隨時(shí)間溶解的高分辨率圖像，并且之前已被用于研究過飽和系統(tǒng)中的微生物生長(zhǎng)和沉淀。
本研究的目的是開發(fā)一種微克級(jí)視頻顯微方法來預(yù)篩選和估計(jì)水溶性差的藥物的溶出度。該方法用于研究6種水溶性差的藥物（卡維地洛、地西泮、雙嘧達(dá)莫、非洛地平、非諾貝特和消炎痛）在禁食狀態(tài)模擬腸液(FaSSIF)中、消炎痛在不同pH磷酸鹽緩沖液中的溶出度，以及在定制的生物相關(guān)介質(zhì)中使用地西泮和雙嘧達(dá)莫。選擇這些藥物來代表早期藥物開發(fā)過程中感興趣的微水溶性候選藥物。另一個(gè)目的是評(píng)估藥物顆粒溶解時(shí)的形態(tài)，確定它們的粒度分布，并跟蹤卡馬西平在磷酸鹽緩沖液中的固態(tài)轉(zhuǎn)化跡象。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
使用oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（BioSense）進(jìn)行藥物的視頻顯微溶出測(cè)試。該設(shè)備以設(shè)定的時(shí)間間隔獲取圖像以生成延時(shí)視頻，使用6-96孔微量滴定板作為樣品容器，顯微鏡單元帶有連接到機(jī)械臂的攝像頭和照明源，用于獲取樣品內(nèi)容的圖像井。1.3μm顯微鏡的光學(xué)分辨率允許檢測(cè)0.5μm和1 mm之間的微型物體，使其適用于藥物顆粒、微粉化顆粒和新結(jié)晶顆粒的顯微鏡檢查，因?yàn)檫@些通常適合可觀察的尺寸區(qū)間。oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)具有4倍光學(xué)放大倍率，可在2分鐘和36秒內(nèi)掃描完整的96孔板。該設(shè)備通過一組定制的圖像分析算法分析獲得的溶解圖像。圖像分割算法通過結(jié)合使用形態(tài)圖像重建和紋理分析對(duì)圖像進(jìn)行二值化來識(shí)別圖像中存在的粒子。為了分離連接的粒子，二值化圖像通過結(jié)合二值掩模和灰度圖像的測(cè)地線分水嶺變換進(jìn)一步處理和細(xì)化。對(duì)于所有已識(shí)別的顆粒，顆粒形狀和形態(tài)參數(shù)，例如面積、具有等投影面積(EQPC)的圓的直徑和Feret直徑，均根據(jù)國(guó)際ISO 9276-6標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
在這項(xiàng)研究中證明了視頻顯微溶出測(cè)試可用于根據(jù)溶出速率對(duì)藥物進(jìn)行分組，以及研究和跟蹤溶出過程中的相變行為和沉淀，而傳統(tǒng)方法通常需要額外的測(cè)試。這一發(fā)現(xiàn)突出了使用基于顯微鏡的溶出方法的優(yōu)勢(shì)之一，因?yàn)樵陂_發(fā)過程的早期描述NCE的溶出行為對(duì)于進(jìn)一步的藥物開發(fā)至關(guān)重要。視頻顯微溶出度測(cè)試可以使用低至480μg的藥物和4.3 mL的介質(zhì)進(jìn)行24個(gè)孔，使其成為早期NCE開發(fā)過程中的有效溶出篩選方法。使用oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的視頻顯微裝置可作為概念證明，在進(jìn)一步開發(fā)后，它可以用作藥物開發(fā)早期階段的調(diào)查篩選工具，并在開發(fā)過程中協(xié)助決策。
圖1、FaSSIF中消炎痛溶出實(shí)驗(yàn)的24個(gè)孔中所有粒子的溶出率，作為其各自粒子面積的函數(shù)。
圖2、a）顯示消炎痛顆粒的視頻顯微溶出測(cè)試的原始輸出圖像。b）圖像分析算法識(shí)別的消炎痛顆粒，如藍(lán)色邊界框所示，以及由紅色輪廓可視化的暴露表面。c）來自單個(gè)顆粒的消炎痛溶出數(shù)據(jù)的線性回歸，顯示溶出速率為10.11μm2 min-1。R2=0.988
圖3、在pH 6.5的FaSSIF中卡馬西平顆粒的30分鐘延時(shí)。b為識(shí)別和分析粒子而開發(fā)的算法無法將不透明粒子和透明粒子彼此分開。紅色箭頭表示存在柱狀卡馬西平沉淀；藍(lán)色箭頭表示存在針狀卡馬西平沉淀。
圖4、視頻-顯微溶出度測(cè)試數(shù)據(jù)與常規(guī)小規(guī)模溶出度測(cè)試數(shù)據(jù)的相關(guān)圖。R 2=0.87，斯皮爾曼的ρ=0.92，p=0.0013。進(jìn)行了單向方差分析統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。(**):p=0.0012;(****)：p<0.0001。●：地西泮，■：卡維地洛，▲：消炎痛，?：消炎痛pH 6.0，?：消炎痛pH 6.5，○：消炎痛pH 5.5，□：雙嘧達(dá)莫，△：非洛地平，▽：非諾貝特。
圖5、不同濃度膽汁鹽和溶血磷脂對(duì)視頻顯微試驗(yàn)。a）雙嘧達(dá)莫和b）地西泮以及常規(guī)小規(guī)模溶出試驗(yàn)中c）雙嘧達(dá)莫和d）地西泮溶出度的影響。溶血磷脂(LPL)濃度對(duì)e）雙嘧達(dá)莫和f地西泮溶出率的影響。左側(cè)y軸(●)為視頻顯微溶出測(cè)試數(shù)據(jù)，右側(cè)y軸(○)為常規(guī)小規(guī)模溶出測(cè)試數(shù)據(jù)。進(jìn)行了單向方差分析統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。
總結(jié)
本文討論的方法可以在未來開發(fā)有效的抗菌化合物以改善衛(wèi)生和全球食品安全方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。水溶性差是新候選藥物的共同特征，這導(dǎo)致口服生物利用度低或不一致。這引發(fā)了對(duì)溶解度和溶出度的材料有效測(cè)試的興趣。本論文目的是開發(fā)一種微克級(jí)視頻顯微方法（Biosense微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)）來篩選水溶性差的藥物的溶出率。該方法應(yīng)用于禁食狀態(tài)模擬腸液(FaSSIF)中的六種藥物（卡維地洛、地西泮、潘生丁、非洛地平、非諾貝特和吲哚美辛）、不同pH緩沖液中的吲哚美辛以及定制培養(yǎng)基中的地西泮和潘生丁。另一個(gè)目的是跟蹤FaSSIF中卡馬西平的相變。通過使用光學(xué)視頻顯微鏡（Biosense微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)）隨時(shí)間跟蹤顆粒表面積來研究藥物的溶出速率和顆粒行為。一種設(shè)計(jì)視頻顯微溶出方法的方法是使用96孔微量滴定板作為樣品容器，如在oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中，該方法可以同時(shí)運(yùn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)，樣品體積很小。當(dāng)使用96孔微量滴定板進(jìn)行溶出實(shí)驗(yàn)時(shí)，所使用的介質(zhì)體積和藥物質(zhì)量會(huì)大大降低。將顯微鏡連接到機(jī)械臂上，所有重復(fù)均以一致的方式自動(dòng)執(zhí)行溶出數(shù)據(jù)采集。與視頻顯微鏡設(shè)置一樣，應(yīng)用微型紫外光譜溶解產(chǎn)生了類似的溶解速率和pH效應(yīng)分組。使用定制介質(zhì)表明溶血磷脂提高了地西泮和雙嘧達(dá)莫的溶出速率。視頻顯微鏡設(shè)置允許隨著時(shí)間的推移跟蹤溶解的卡馬西平顆粒上透明顆粒的成核。開發(fā)的設(shè)置提供了一種材料有效的篩選方法，可根據(jù)溶出率對(duì)藥物進(jìn)行分組，其中使用光學(xué)顯微鏡有助于實(shí)現(xiàn)高樣品通量。使用定制介質(zhì)表明溶血磷脂提高了地西泮和雙嘧達(dá)莫的溶出速率。視頻顯微鏡設(shè)置允許隨著時(shí)間的推移跟蹤溶解的卡馬西平顆粒上透明顆粒的成核。開發(fā)的設(shè)置提供了一種材料有效的篩選方法，可根據(jù)溶出率對(duì)藥物進(jìn)行分組，其中使用光學(xué)顯微鏡有助于實(shí)現(xiàn)高樣品通量。使用定制介質(zhì)表明溶血磷脂提高了地西泮和雙嘧達(dá)莫的溶出速率。視頻顯微鏡設(shè)置允許隨著時(shí)間的推移跟蹤溶解的卡馬西平顆粒上透明顆粒的成核。開發(fā)的設(shè)置提供了一種材料有效的篩選方法，可根據(jù)溶出率對(duì)藥物進(jìn)行分組，其中使用光學(xué)顯微鏡有助于實(shí)現(xiàn)高樣品通量。
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