維氏氣單胞菌分離與純化、一步生長曲線、熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性研究（一）
維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種人—獸—魚共患的條件致病菌，該菌可感染草魚、鯽、泥鰍、青蝦、中華絨螯蟹、中華條頸龜、達氏鱘、虹鱒、大黃魚等多種水生動物，引發(fā)的疾病發(fā)病快、死亡率高，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。研究人員發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌對β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林鈉、苯唑西林)、大環(huán)內(nèi)酯類(硫氰酸紅霉素、乙酰螺旋霉素)、喹諾酮類(恩諾沙星)、氨基糖苷類(硫酸新霉素、卡那霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素、強力霉素)、磺胺類(磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑)、氯霉素類(甲砜霉素、氟苯尼考)等抗菌藥均產(chǎn)生了一定的耐藥性，且極可能會隨著抗菌藥的繼續(xù)濫用而在水生動物臨床上更加快速且廣泛地傳播。同時，抗菌藥的廣譜性會破壞水體環(huán)境及養(yǎng)殖動物腸道中正常微生物群系的平衡，影響?zhàn)B殖魚類的生長發(fā)育，進而造成水產(chǎn)養(yǎng)殖效率低下。因此，尋找安全、高效、環(huán)保的生物抑菌劑具有重要意義。噬菌體(Baceriophage)是一類能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋菌等微生物的病毒總稱，它具有裂解宿主專一性強、研發(fā)時間短，不影響正常菌群，對人和動物安全，耐藥風(fēng)險低且無環(huán)境污染等優(yōu)點，其在細菌病防控領(lǐng)域的應(yīng)用研究呈逐年上升趨勢。
目前，已報道用于水生動物細菌病防控的噬菌體研究數(shù)量有限，為了豐富水產(chǎn)致病菌的噬菌體庫，篩選具有潛在應(yīng)用價值的菌株，本試驗以維氏氣單胞菌為宿主菌，分離篩選烈性噬菌體，研究其生物學(xué)特性，旨在為進一步探索噬菌體防控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。
1材料與方法
1.1菌株維氏氣單胞菌(XJJYCA01)分離自發(fā)病鯽魚，LB斜面保存于4℃。
1.2試劑與儀器試劑耗材：LB培養(yǎng)基、SM液、接種環(huán)、5 mL注射器、0.22μm過濾頭、一次性培養(yǎng)皿等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。儀器：UV-2600紫外分光光度計、離心機(Eppendorf Centrifuge 5427R和Hermle Z323K)、HS-2恒溫水浴鍋、Hitachi H-7650型電子顯微鏡、JJ-Y系列電子天平、生化培養(yǎng)箱等。
1.3噬菌體分離與純化
參照雙層平板法進行維氏氣單胞菌的富集、篩選、純化，略作修改。步驟如下：(1)無菌操作解剖，取發(fā)病鯽魚腸道置于滅菌培養(yǎng)皿中，用生理鹽水洗脫腸道內(nèi)容物，4 000 r/min離心10 min后過0.22μm濾頭備用；(2)挑取維氏氣單胞菌(XJJYCA01)單菌落接種到含有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，28℃120 r/min搖床上過夜培養(yǎng)；翌日，將其轉(zhuǎn)到含25～30 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃120 r/min震蕩培養(yǎng)3 h，使其達到對數(shù)期(OD值0.4～0.6)，然后向菌液中加入5 mL病魚腸道洗脫液，再28℃振蕩培養(yǎng)48 h。之后將混合液以12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一無菌螺旋離心管后備用；(3)取100μL分離液與200μL對數(shù)期的宿主菌混合，放置5～15 min后加到融化并冷卻至45℃的半固體培養(yǎng)基中，混勻立即倒入底層瓊脂平板上，鋪勻，28℃倒置培養(yǎng)24 h。翌日觀察噬菌斑的生成情況；(4)用滅菌牙簽挑取單個噬菌斑，接到5 mL液體培養(yǎng)基中富集10 min，然后向其中加入200μL宿主菌菌液，28℃培養(yǎng)2～3 h至液體澄清后，12 000 r/min離心取上清，即得到高效價的噬菌體。
1.4噬菌體效價的測定
采用噬斑法測定噬菌體效價。吸取100μL純化的噬菌體液進行10倍稀釋，將稀釋的噬菌體液分別與200μL的XJJYCA01混合，利用雙層平板法觀察噬菌斑的個數(shù)。效價(PFU/mL)=噬菌斑數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。
1.5噬菌體的電鏡觀察
參照Ramíre-orozco等的方法，采用磷鎢酸負染法，用Hitachi H-7650型電子顯微鏡進行電鏡觀察。
1.6噬菌體最適感染復(fù)數(shù)(MOI)測定
培養(yǎng)XJJYCA01至對數(shù)生長期(OD600≈0.5，約為1×108CFU/mL)，按照不同的感染復(fù)數(shù)(1 000，100，10，1，0.1，0.01，0.001)各取0.2 mL混合，并加入1.6 mL的LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)4 h。經(jīng)培養(yǎng)后，9 000 r/min離心10 min，0.22μm過濾。收集上清，測定噬菌體效價，以產(chǎn)生最高噬菌體效價的MOI為最佳感染復(fù)數(shù)。
1.7一步生長曲線
具體操作如下：將XJJYCA01培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將噬菌體SJTJYCA01效價濃度稀釋到1×108PFU/mL。1 mL噬菌體稀釋液和10 mL宿主菌細菌懸液混合于錐形瓶P1中，混合10 min后，取0.1 mL加入到含有10 mL LB培養(yǎng)液的錐形瓶P2中，混合均勻，再從錐形瓶B2中取0.2 mL至含有20 mL液體培養(yǎng)基的P3中，混合均勻后在28℃及180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。從0開始每隔一段時間取樣。所取樣品經(jīng)9 000 r/min離心2 min，取上清液用雙層平板法測定過濾液中噬菌體的效價。以取樣時間為橫坐標，噬菌體效價的對數(shù)值為縱坐標，繪制一步生長曲線。裂解量=裂解期平均噬菌體數(shù)/潛伏期平均噬菌體數(shù)。
1.8熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性
將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，分裝到3個5 mL離心管中，每管各裝3 mL。將離心管分別放置于40℃、60℃、80℃的恒溫水浴鍋中，每隔20 min測定各管中噬菌體的效價，直至測到60 min。以SM液為介質(zhì)，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH(3～11)。將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，取10μL加入到990μL不同pH的SM液中，28℃水浴2 h后測定各離心管中噬菌體的滴度。每個pH試驗重復(fù)3次。
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