?4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態、生物學特性、生長曲線及基因組特征（三）
2.6一步生長曲線
將噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14分別與宿主菌混合后培養，得到噬菌體的一步生長曲線。如圖6所示，烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15侵染宿主的10 min內效價無明顯變化，表明它們的潛伏期均為10 min。在10～150 min內，噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15的效價一直保持升高趨勢，隨后趨于穩定，表明它們的裂解期均約為140 min，裂解量分別約為每個細胞210和322 PFU。而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的潛伏期較長，分別約為15和30 min；裂解期較短，分別約為30和45 min，裂解量分別為每個細胞52和49 PFU。上述結果顯示，烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15的裂解量均高于Gutierrez等分離的金葡菌烈性噬菌體（每個細胞15和25 PFU）。溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的裂解量比Feng等分離的溫和噬菌體JD419裂解量（每個細胞33 PFU）更高。潛伏期和爆發量是表示噬菌體裂解能力的重要生物學特性，具有較短潛伏期和較大爆發量的噬菌體更適合作為生物防治劑。
圖6噬菌體的一步生長曲線
2.7系統發育樹
全基因組序列分析結果顯示烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15基因組全長分別為140 584 bp和135 178 bp，而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的基因組全長分別為44 922 bp和44 232 bp。其中噬菌體SAPYZU-04的GC含量為31.48%，預測到188個ORFs；噬菌體SAPYZU-15的GC含量為29.90%，預測到187個ORFs；噬菌體SAPYZU-SapM13的GC含量為33.98%，包含71個ORFs；噬菌體SAPYZU-SapM14的GC含量為33.89%，包括73個ORFs。
截至2021年4月，GenBank數據庫中記錄192個金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列。本研究通過這些金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列進行系統發育分析，解析4株噬菌體和其他金黃色葡萄球菌噬菌體之間的關系。此樹形圖（圖7）劃分了3個主要的遺傳譜系（I-Ⅲ）。聚類分析結果表明，烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15與Hellelleviridae科的噬菌體聚在一個譜系中（譜系Ⅱ），且SAPYZU-04和SAPYZU-15與噬菌體qdsa001基因組核苷酸序列最相似，相似性＞99.0%；溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14與Azeredovirinae亞科Dubowvirus屬的噬菌體聚在一個譜系中（譜系Ⅲ），且SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14與TEM126和SAP26的基因組核苷酸序列一致性＞95%。因此，根據ICTV2022年最新的分類標準，噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15屬于Hellelleviridae科；而SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14屬于Azeredovirinae亞科Dubowvirus屬。
圖7系統發育分析
2.8全基因組序列分析
對4株噬菌體基因組攜帶基因的蛋白功能進行注釋，結果如圖8所示。噬菌體SAPYZU-04的基因組編碼32個DNA代謝相關基因，包括核酸內切酶基因（orf38）、DNA解旋酶基因（orf115）和DNA聚合酶Ⅰ基因（orf144）等；噬菌體SAPYZU-15的基因組包含多個DNA代謝基因，其中包括3個DNA合成相關基因（orf1、orf3和orf5）、2個DNA聚合酶Ⅰ（orf10、orf11）和DNA綁定蛋白（orf82）；噬菌體SAPYZU-SapM13的基因組編碼13個與噬菌體DNA復制、調節和轉錄相關的基因，包括核酸外切酶基因（orf7）、轉錄因子（orf9）、DNA復制基因（orf25）和DNA解旋酶（orf45）等；而噬菌體SAPYZU-SapM14編碼11個與噬菌體DNA代謝相關的基因，包括轉錄因子（orf11）、DNA綁定蛋白（orf24）、DNA解旋酶（orf28）和核酸內切酶（orf51）等。其中SAPYZU-15基因組編碼豐富的DNA合成基因加速了噬菌體大分子的合成。SAPYZU-04的基因組編碼3個DNA組裝基因（orf66、orf68和orf69），SAPYZU-15的基因組編碼1個DNA組裝基因（orf117），SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14均包含2個DNA包裝基因（分別為orf48、orf49、orf52和orf53）。其中SAPYZU-15編碼的DNA包裝基因與噬菌體LSA2308的氨基酸序列具有95.9%的相似性；LSA2308的爆發量約為407 PFU/cell。DNA包裝蛋白可以有效地將DNA泵入尾部噬菌體原衣殼中，加速噬菌體的組裝。噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15的基因組中分別包含3個和1個尾部蛋白基因（分別為orf108、orf110、orf158和orf142），噬菌體SAPYZU-SapM13編碼5個尾部相關蛋白基因，包括尾管蛋白基因（orf57）和主要尾部蛋白基因（orf58和orf62）等；而SAPYZU-SapM14編碼6個尾部相關蛋白基因，包括尾部蛋白基因（orf57、orf61、orf62）等。這些獨特的尾部蛋白基因可能是此4株噬菌體具有廣泛的裂解譜的原因。其中SapYZU-15含有的尾蛋白基因與噬菌體KSAP11的基因組氨基酸序列有95.90%的相似性。KSAP11具有廣泛的裂解譜，對30株SA菌株（包括MSSA和MRSA菌株）具有裂解活性。噬菌體SAPYZU-04包含1個穿孔素基因（orf53）和3個裂解酶基因（orf52、orf100和orf102），SAPYZU-15包含1個穿孔素基因（orf107）、5個裂解酶基因（orf103、orf105、orf149、orf153和orf155）；而SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的基因組均只包含1個穿孔素基因（分別為orf70和orf2）和1個裂解酶基因（分別為orf71和orf3）。穿孔素基因在裂解過程中誘導宿主細胞膜去極化，調節裂解時間。其中SAPYZU-15基因組中有2個裂解酶基因（orf103和orf155）與MR003具有較高的氨基酸序列相似性（97.90%和99.00%），MR003是高效的SA烈性噬菌體。因此，在這些基因的協同作用下，噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15潛伏期更短，裂解量更高。此外，溫和噬菌體基因組中的整合酶基因和CI阻遏蛋白是決定其生命周期的重要因素，整合酶基因通過催化兩個DNA分子之間重組使得噬菌體在宿主染色體中進行基因的整合和切除，并且溫和噬菌體通過CI阻遏蛋白阻斷裂解基因的轉錄和翻譯，從而進入溶原周期；而抗阻遏蛋白控制噬菌體在侵染時進入裂解周期。本文的溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14基因組編碼特異性整合酶證明它們具有溶原性，均預測到抗阻遏蛋白，但是未預測到CI阻遏蛋白和噬菌體抗性基因，可能導致溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在宿主譜測定時易進入裂解周期，上述結果與Tian等的研究結果一致。
圖8全基因組分析
3、結論
金黃色葡萄球菌嚴重威脅食品安全，同時也是全球關注的重大公共衛生問題之一。因此，迫切需要開發安全可靠的生物防治方法，以提高公共衛生水平，確保消費者安全。本研究分離的烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15效價均達到109PFU/mL，而且具有較寬的裂解譜，兩株噬菌體對51株SA菌株的裂解率均高達100%；在40～60℃溫度范圍內、pH值在3～12范圍內均保持良好活性；潛伏期較短、裂解能力強，裂解量分別高達每個細胞210和322 PFU。全基因組序列分析結果顯示SAPYZU-04和SAPYZU-15均包含多種DNA代謝基因、多個裂解酶基因、獨特的DNA包裝基因及尾部蛋白基因。因此，烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15是一種更合適、更有前景的生物防治選擇，有望應用于控制食品中金葡菌的污染。
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態、生物學特性、生長曲線及基因組特征（一）
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態、生物學特性、生長曲線及基因組特征（二）
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態、生物學特性、生長曲線及基因組特征（三）
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