Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨及聯合暴露對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的毒性作用（一）
重金屬污染一直受到國際、國內社會的高度關注。重金屬沿著食物鏈，通過生物積累對生物體造成嚴重的健康威脅。我國南方地區有色金屬開采和冶煉活動的快速擴張導致鎘、銅及其他金屬污染嚴重，其中稻田鎘污染導致稻米中鎘含量超過食品安全標準限值。不同重金屬種類、有效性、存在形態及含量對生物體產生的毒害效果不同。大多數金屬陽離子會與蛋白質有效絡合，從而形成不同的金屬離子-有機絡合物，而目前有關金屬和其他物質聯合暴露對生物體的毒性研究較為匱乏。因此探究重金屬與其他物質聯合暴露對生物體的毒性，可以更好地了解重金屬對生物體的毒性行為。
蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌，其分泌的結晶蛋白（如Cry1Ab和Cry1Ac）可通過復雜的毒性機制控制鱗翅目昆蟲。Bt轉基因作物被大規模商業化推廣種植，從而導致大量Bt毒素蛋白通過植物根系分泌、秸稈還田和花粉飄落的方式進入土壤和水生生態系統，Bt蛋白進入土壤初期會對土壤酶活性產生影響。研究表明Bt毒素進入土壤環境后會與其他污染物，如殺蟲劑、抗生素、重金屬等相互結合。Bt蛋白因富含酸性氨基酸結構而具有較強的金屬絡合能力，其傾向與過渡金屬離子形成復合物，目前關于Bt抗蟲蛋白和重金屬聯合暴露對微生物的毒理作用研究較少。因此，評估兩者聯合暴露對微生物活性的影響具有重要意義。
本研究以Cry1Ac蛋白作為Bt蛋白代表，以Zn2+、Cd2+作為重金屬代表，以大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為受試模式生物，分析Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨及聯合暴露對兩種細菌的毒性作用，以期為重金屬與Bt毒素聯合暴露對微生物的生態安全風險進行有效評估。
1材料與方法
1.1菌種及培養基配制
1.1.1菌種來源
大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Ba?cillus subtilis）由湖南農業大學微生物實驗室提供；發光細菌為費氏弧菌（Vibrio fischeri），購自浙江清華長三角研究院。
1.1.2 LB培養基
液體培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超純水1 L、121℃滅菌25 min。
固體培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超純水1 L、加入1.5%瓊脂、121℃滅菌25 min。
1.2實驗方法
1.2.1細菌的生長曲線實驗
將1 mL不同濃度的Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單一及復合體系分別與1 mL菌懸液和8 mL液體培養基混合，最終Zn2+濃度為2、4、8、12、16、20μg?mL-1，Cd2+濃度為2、4、6、8、10μg?mL-1，Cry1Ac蛋白濃度為0.2、0.8、1、2、4μg?mL-1，復合體系的濃度配比為1∶1，濃度為0.2、1、2、4μg?mL-1，培養24 h。不添加Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白的對照組加入1 mL蒸餾水。
1.2.2平板計數
在固體LB培養基中分別加入不同濃度的Zn2+、Cd2+及Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac復合體系（Zn2+：4、8、12、16、20μg?mL-1；Cd2+：2、4、6、8、10μg?mL-1；復合體系：2、4μg?mL-1）溶液，將對數期的E.coli和B.subti?lis菌液稀釋6倍，分別取100μL均勻涂布于各平板上，在37℃恒溫培養12 h后進行活菌計數。以不添加Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白培養的細菌菌落數作為對照活菌數（CK），用立體計數儀對活菌進行計數，記錄各平板上的菌落數，選取菌落數在30~300個之間的平板用于計算，求出同一處理組平板上生長的平均菌落數。由公式（1）計算存活率：1.2.3細菌活性氧測定
按照1.2.2的步驟收集處理后的E.coli和B.subtilis菌液至50 mL離心管，6 000 r?min-1離心10 min；用pH為7.02的PBS緩沖液洗滌，6 000 r?min-1離心5 min，渦旋去除殘留；取10μL的活性氧（ROS）熒光探針（濃度為10 mol?L-1的DCFH-DA）工作液染色30 min，避光37℃孵育30 min，每隔10 min輕輕搖動；孵育結束用磷酸鹽緩沖液充分洗滌；用酶標儀在發射波長530 nm處檢測樣品的熒光強度。
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