豬鏈球菌對34種常用藥物的敏感性檢測【藥敏實驗】
摘要：豬鏈球菌是一種常見的病原菌，能引起動物和人類發生豬鏈球菌病，本實驗通過在山西靈石某豬場發病豬群中取樣，分離病原菌，并且對病原菌進行培養、鏡檢、生化鑒定以及PCR的技術擴增其gdh和16srRNA的序列，然后進行藥敏實驗。鑒定出分離菌能夠在鮮血平板上形成溶血環、革蘭氏染色陽性、43種生化試驗結果以及擴增出特異性條帶，表明分離到的病原菌為豬鏈球菌。藥敏實驗結果可見其對強力霉素等藥物敏感，而對頭孢曲松和磷霉素完全耐藥。為山西地區豬鏈球菌的防治提供參考。
豬鏈球菌可引起豬的敗血癥、腦膜炎、心內膜炎、關節炎等癥狀。它是世界范圍內引發豬鏈球菌病最主要的病原，目前已確定有35（1～34及1/2）個血清型，不同國家和地區具有不同的流行株，其中2型流行最廣、致病性最強。
豬鏈球菌不斷的在各地發生，其對藥物的敏感程度也在不斷的發生變化，特別是對一些常用藥的敏感性降低，甚至出現耐藥菌，趙慧梅等對山西地區豬鏈球菌分離株進行藥敏實驗可見大多對鏈霉素和慶大霉素耐藥。湖南分離到的豬鏈球菌對四環素和磺胺甲惡唑耐藥率達到100%。
本研究對山西地區分離到的豬鏈球菌進行藥敏實驗，通過對34種常用藥物的敏感性檢測，旨在為山西省篩選藥物防治豬鏈球菌病提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1病料來源疑似豬鏈球菌感染的組織器官采集于山西靈石縣某豬場。
1.1.2主要試劑血瓊脂平板培養基購于鄭州安圖綠科生物工程有限公司。TSA和TSB培養基購于美國BD公司。新生牛血清購于杭州四季青生物公司。核酸分子量標準物Trans2K plus DNA Marker購自北京東盛生物有限公司。細菌全基因組快速提取試劑盒購自北京捷瑞生物有限公司。鏈球菌參考血清購自丹麥皇家血清研究所（Statens Seruminstitut，Copenhagen，Denmar k），引物是由上海生工有限公司合成。測序由上海生工有限公司完成。生化鑒定由山西醫學科學院山西大醫院檢驗科完成。
1.1.3藥敏紙片藥敏紙片購于北京天壇藥物生物技術開發公司，共34種，藥物如下：青霉素、氨芐西林、鏈霉素、慶大霉素、硫酸新霉素、卡那霉素、紅霉素、阿奇霉素、頭孢噻吩、頭孢拉定、頭孢唑啉、氧氟沙星、諾氟沙星、強力霉素、環丙沙星、頭孢曲松、鹽酸林可霉素、鹽酸恩諾沙星、阿米卡星、磷霉素、磺胺嘧啶鈉、頭孢哌酮、頭孢呋辛鈉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、苯唑西林、乙酰螺旋霉素、磺胺氯吡嗪鈉、硫酸粘桿菌素、鹽酸沙拉沙星、硫酸安普霉素、鹽酸林可霉素、鹽酸土霉素。
1.2方法
1.2.1病原的分離培養無菌收集發病豬的關節液，肝臟，心臟，脾臟等器官，將采集的病料劃線接種于添加有5%新生牛血清的TSA培養基，37℃24 h后挑取針尖大小、灰白色、呈圓形、表面光滑、邊緣整齊的菌落純培養接種于鮮血瓊脂平板。
1.2.2鏡檢對可見溶血環的疑似菌落進行革蘭氏染色，結晶紫1 min，碘液1 min，酒精脫色30 s，復紅50 s，油鏡下鏡檢觀察。
1.2.3生化鑒定挑取TSA培養基上純培養的單個菌落接種于TSB中，37℃靜置培養24 h后的菌液送檢。
1.2.4細菌DNA提取及PCR擴增對病原菌使用細菌全基因組快速提取試劑盒，鏡檢呈陽性，生化鑒定為鏈球菌，提取全基因組。具體步驟為：挑取TSA復蘇的單菌落，在含5%新生牛血清的TSB培養基中培養約10 h，取2 mL菌液4 000 rpm離心5 min以收集菌液，將菌沉淀重懸，加10μL 10 mg/mL溶菌酶溶液，充分混勻后于37℃靜置30 min以上，以破除細胞壁。破壁后加入混有SDS的15 mg/mL蛋白酶K 30μL，于55℃水浴2 h，加等量酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），8 000 rpm離心10 min。此時吸取上層清液于另一EP管中，于其中加異丙醇使DNA完全沉淀，8 000 rpm離心5 min取沉淀。使用冷乙醇洗滌沉淀，同上步離心棄上清液，向沉淀中加DNA洗脫液靜置充分溶解DNA，4℃保存備用。以提取出來的基因組為模板，對分離菌的gdh基因和16SrRNA序列擴增的方法進行分子鑒定，使用華中農業大學農業微生物重點實驗室設計的引物擴增。
1.2.5藥敏實驗采用K-B紙片擴散法，挑取豬鏈球菌單個菌落密集均勻地涂布整個平板，將含有抗生素藥物的濾紙片用燒灼滅菌的鑷子分別貼于平板表面，相互間應間隔一定距離，37℃培養24 h后，觀察結果。判定標準：應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。
2結果
2.1病原分離培養結果
從發病豬內臟器官和關節等部位分離到的病原菌在鮮血瓊脂培養基上生長良好，菌落周圍有透明溶血環。
2.2病原菌鏡檢結果
病原菌革蘭氏染色鏡檢為G+，染成紫色的球菌呈單個、兩個相連或連接呈現短鏈狀（見圖1）。
2.3生化鑒定結果
經43種生化試驗，分離菌株符合豬鏈球菌的生化培養特性，鑒定為豬鏈球菌（見表2）。
2.4 PCR擴增結果
擴增豬鏈球菌的gdh基因后得到566 bp的條帶。16srRNA基因擴增可見有1411 bp的條帶。
2.5藥敏試驗結果
用34種藥物對分離到的豬鏈球菌進行藥敏實驗，結果見表3。
由表可見，豬鏈球菌分離株對強力霉素、卡那霉素等藥物敏感，而對頭孢曲松和磷霉素完全耐藥。
3討論
豬鏈球菌的鑒定一般采用培養特性及生化實驗，溶血實驗等，也有用PCR的方法擴增其gdh基因和16srRNA基因序列的并將其擴增測序以及同源性比對。還有人通過擴增其cps和epf基因來鑒定豬鏈球菌。本實驗結合傳統生長生化實驗，溶血實驗與PCR擴增其gdh基因和16srRNA基因的方法來鑒定豬鏈球菌尚屬國內首例。
由于藥物的不合理使用，導致豬鏈球菌耐藥株的出現，各地均出現了不同藥物的耐藥株，常見藥物對豬鏈球菌2型的敏感性呈現下降趨勢，耐藥普擴大。本實驗的結果卻是對生產中較為常用的強力霉素、卡那霉素、紅霉素及環丙沙星等藥物均敏感，而對頭孢曲松和磷霉素出現耐藥性。這可能與養殖場管理人員的思維定勢有關，認為常用抗生素使用過頻，耐藥性肯定會嚴重，轉而使用生產中不常用的頭孢曲松和磷霉素，造成鏈球菌對這兩種藥物產生耐藥性，導致防治不力。因此在生產用藥中應該做到輪換用藥和聯合用藥，降低病原菌產生耐藥性的速度。