水貂腸道乳酸桿菌RSJ生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸、藥敏試驗(yàn)結(jié)果（一）
近年來，水貂等小型毛皮動(dòng)物消化道菌群的研究已成為一個(gè)重要的新課題。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)動(dòng)物消化道菌群的研究報(bào)道較少，尤其是對(duì)水貂腸道菌群的研究未見報(bào)道。其中，乳酸菌作為動(dòng)物腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群之一，其對(duì)動(dòng)物的有益作用已被許多研究結(jié)果所證實(shí)。乳酸桿菌是仔豬腸道正常微生物區(qū)系中的優(yōu)勢(shì)菌群，可利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸、乙酸及其他揮發(fā)性脂肪酸，對(duì)維持仔豬腸道微生物區(qū)系平衡和消化機(jī)能起著重要作用。市售乳酸桿菌菌株大部分是從人和哺乳動(dòng)物腸道中或土壤中分離得到的。寄主的遺傳特性和環(huán)境影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成，寄主和腸道菌之間存在著相互選擇、相互依賴的關(guān)系，因而一種適于某類動(dòng)物的微生態(tài)制劑不一定適于另一類動(dòng)物。要保持定植能力，活菌制劑的生產(chǎn)菌種應(yīng)從同種屬宿主分離。鑒于此,本研究擬從健康水貂腸道中分離篩選出耐酸、抑菌效果好、安全等特點(diǎn)的菌株，為開發(fā)應(yīng)用于防治水貂腹瀉性疾病的微生態(tài)制劑提供參考依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗(yàn)材料
健康成年丹麥紅眼母貂1只，來自青島某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。
1.1.2主要試劑
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)公司，莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司、糖醇發(fā)酵管(葡、麥、蔗、乳、甘、木、果、山、七葉苷等)、藥敏紙片購(gòu)杭州天和微生物試劑有限公司。
1.1.3 DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增所用試劑
PBS緩沖液，TE緩沖液，細(xì)菌裂解液，Premixed Taq(incl dye)、DL 2 000 DNA Marker購(gòu)自北京托普賽生物有限公司，電泳級(jí)瓊脂糖Agarose Regular購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2方法
1.2.1樣品的采集與處理
分別取各段腸粘膜和糞便樣品1 g，分別置于含生理鹽水9 mL三角瓶，振蕩混勻30 min，制成勻漿后，靜置15 min，制成10-1的稀釋液。
1.2.2分離純化
取樣品的稀釋液100μL涂布于含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基上，厭氧37℃培養(yǎng)24 h。挑取有溶鈣圈的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。疑似陽(yáng)性的菌落接種到莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。
1.2.3生化試驗(yàn)
鑒定按常規(guī)方法對(duì)分離的菌株進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)，氧化酶試驗(yàn)、KOH試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)及運(yùn)動(dòng)力試驗(yàn)等。
1.2.4 16S rRNA基因片段的序列分析將分離的菌株接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，取4.5 mL菌液12 000 r/min離心2 min，參考文獻(xiàn)的方法提取DNA。
參考相關(guān)文獻(xiàn)，由上海生工生物工程有限公司合成了一對(duì)為乳酸桿菌屬特異性引物(Lac16S正向371 5'-GCAGTAGGGAATCTTCCACA-3'，Lac16S反向593 5'-GCTTTA CGCCCAATAAATC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為223 bp)。
PCR反應(yīng)體系：Premixed Taq 25μL，正反向引物各加1μL，DNA模板2μL，補(bǔ)ddH2O至體積為50μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5 min預(yù)變性；94℃30 s變性，56℃30 s退火，72℃30 s延伸，循環(huán)35次；72℃5 min延伸。取5μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)電泳后在凝膠成像儀中觀察擴(kuò)增結(jié)果。
PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。采用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄的乳酸桿菌屬16S rRNA的序列比對(duì)，并使用MegAlian中的Clustal X Method進(jìn)行同源性比較。
1.2.5耐酸試驗(yàn)
調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)肉湯pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，分別裝入試管中，每管5 mL。將菌株液體培養(yǎng)物10μL接入，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況。
1.2.6生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸試驗(yàn)
將篩選出的乳酸菌接種于盛有MRS液體培養(yǎng)基(接種量為1∶50)的三角瓶中，37℃，200 r/min培養(yǎng)48 h。其中每隔2 h取樣于紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD值(600 nm)和pH，并繪制曲線。用未接種的培養(yǎng)基作空白對(duì)照。
1.2.7藥敏試驗(yàn)
采用紙片擴(kuò)散試驗(yàn)法。將乳酸菌懸液稀釋至108 cfu/mL后取100 uL涂布于MRS培養(yǎng)基上，用滅菌的鑷子將藥敏片貼到培養(yǎng)基表面，輕輕壓實(shí)。將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定藥敏圈直徑。
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